紅外光譜高效液相色譜法鑒定出土酒殘留物

溫 睿，王乃慧，李引麗，喬建軍，代 鋒

(1.西北大學 文化遺產學院/文化遺產研究與保護技術教育部重點實驗室，陜西 西安 710069;2.榆林市文物保護研究所 文物保護室,榆林 719000)

根據文獻記載,我國古代有以酒隨葬的葬俗，最早見于《禮記雜記上》,其載:醴者,稻醴也。甕、甒、筲、衡實見間[1]。在考古發掘中經常發現墓葬中隨葬酒器,少數酒器中還保留有液體或固體物質。墓葬在幾百上千年的埋葬過程中,會受到地下水、淤土等周邊環境的侵擾,因此,酒器中的液體或固體物質是否為酒的殘留物需要科學分析方法來鑒定。國內、外學者對酒殘留物鑒別進行過一些探索[2-5]。這些研究大都是通過有機酸的檢測,結合考古背景來推測容器中的物質為酒殘留物的。非揮發性有機酸是酒中重要的成味物質，其本身具有酸味和特殊口味[6]。不同酒類的主體有機酸有差別,有一定鑒別意義。但是,除了酒以外其他物質,包括奶、醋、醬油等液體物質均含有有機酸。雖然這些物質盛放在酒器中的可能性較小,但仍然不能從理論上排除這種可能性，在酒器與普通盛放器皿尚未區分的時代,僅通過有機酸來鑒別酒的殘留物則更加缺乏依據。

本文試圖通過紅外光譜與高效液相色譜結合的方法[7-11],建立起一套先區分、后分析的檢測體系,通過本方法對考古出土的樣品進行再分析。

本文檢測的考古樣品來自陜西榆林走馬梁漢墓[12]出土的3件青銅器中的液體和固體殘留物(液體殘留物編號為M2∶6，M11∶2，M11∶5L；固體殘留物編號為M11∶5S)。走馬梁漢墓位于榆林市榆陽區牛家梁鎮的漢代古城灘城址西南1km處的走馬梁,屬于溫帶大陸性氣候,夏季涼爽冬季嚴寒,又緊鄰毛烏素沙漠。這一環境有利于有機物的保存。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司);SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀SPD-20A紫外檢測器(日本島津公司);J&K CHEMICAL C18 WpH反向色譜柱(4.6mm×250mm,5μm,北京百靈威科技有限公司);PAX固相萃取小柱(30mg/3mL,美國安捷倫公司);Vortex Genius 3旋渦混勻器(德國IKA公司)。

溴化鉀(KBr,光譜純,天津中世沃克公司);草酸(Oxalic acid, 99%，體積分數);酒石酸(L-(+)-Tartaric acid,99%，體積分數);丙酮酸(Pyruvic acid,98%);L-(-)-蘋果酸(L-(-)-Malic acid,99%，體積分數);乳酸(L-Lactic acid,85%，體積分數);富馬酸(Fumaric acid,99%，體積分數);檸檬酸(Citric acid,99%，體積分數);琥珀酸(Succinic acid,99%，體積分數)(有機酸均購于北京百靈威科技有限公司);甲醇(CH3OH,色譜純,天津科密歐化學試劑有限公司);磷酸氫二銨((NH4)2HPO4,分析純,天津市恒興化學試劑有限公司);磷酸(H3PO4,分析純,天津市恒興化學試劑有限公司);乙醇(C2H5OH,色譜純,天津科密歐化學試劑有限公司);實驗室用水為Milli-Q超純水。

1.2 標準溶液配制

以草酸0.250mg/mL、酒石酸2.000mg/mL、蘋果酸0.300mg/mL、丙酮酸5.000mg/mL、乳酸5.000mg/mL、檸檬酸6.250mg/mL、富馬酸0.110mg/mL、琥珀酸10.000mg/mL,配制8種有機酸的標準混合溶液。分別配制成標準混合溶液的0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%,2.0%,10.0%,40.0%,100.0%(體積分數)溶液,經0.45μm微孔濾膜過濾后進行分析。

1.3 樣品前處理

131樣品紅外光譜檢測前處理：考慮到殘留物均來源于青銅器中,尤其是固體殘留物銅綠色的特殊性,為防止高含量堿式碳酸銅影響到含量相對較低的有機物的檢測,也為了將結果代入使用現代相關液體建立的判別模型,故僅對液體殘留物進行了紅外光譜檢測。制備干燥溴化鉀壓片。久置的液體殘留物中液體和沉淀已分層,先將其漩渦震蕩0.5min,使液體和沉淀混合均勻,然后迅速以移液器移取0.2mL到溴化鉀壓片上,液體殘留物M11∶2和M11∶5各制3片,40℃下干燥20min。

132樣品有機酸檢測前處理固體:精確稱量0.50g干燥的固體殘留物,研磨后與1mL超純水混合,漩渦震蕩1min,超聲處理30min使其充分溶解,1200r/min離心5min,取上層清液,用0.45μm有機系微孔濾膜過濾,過濾后樣品溶液由淺綠變為無色透明,移入進樣瓶待測。液體及沉淀:久置的樣品中液體和沉淀已分層,先將其漩渦震蕩0.5min,混合均勻,移取0.5mL至離心管內,與0.5mL超純水混合,漩渦震蕩1min,超聲處理30min,1200r/min離心5min,取上層清液。用0.45μm有機系微孔濾膜過濾,過濾后樣品溶液分別由淺綠和淺黃變為無色透明,移入進樣瓶待測。

1.4 優化的儀器工作條件

1.4.1 紅外光譜參數 波數為400～2 000cm-1;分辨率為4cm-1;掃描次數16次。

1.4.2 色譜條件 色譜柱:C18 WpH反向色譜柱(4.6mm×250mm,5μm,北京百靈威科技有限公司);柱溫30℃;進樣量10μL;自動進樣;流動相:A相0.01mol/L (NH4)2HPO4-H3PO4緩沖溶液(以H3PO4調節pH值為2.7)B相100%CH3OH,v(A)∶v(B)=98∶2,等度洗脫,流動相使用前經0.22μm微孔濾膜過濾;洗脫時間12min;流速1.0mL/min;檢測波長210nm。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的和前處理方式的優化實驗

由于文物樣品量非常有限,所以使用標準混合溶液來測評不同溶劑和前處理方法對有機酸的提取效果。

方法a:取0.5mL體積分數10%標準混合溶液,加入0.5mL超純水,震蕩使其充分混合,經0.45μm微孔濾膜過濾后進行分析。

方法b:取0.5mL體積分數10%標準混合溶液,加入0.5mL80%(體積分數)的乙醇溶液,震蕩使其充分混合,經0.45μm微孔濾膜過濾后進行分析。

方法c:取0.5mL體積分數10%標準混合溶液,加入0.5mL超純水,震蕩使其充分混合,共1mL,向其中滴加一滴體積分數3%的氨水溶液,搖勻,pH約為9，呈弱堿性。PAX小柱活化后(用 2mL 甲醇和 2mL 去二次水依次以自重過柱,流速約 0.5mL/min,使 PAX 小柱活化),立即移取1mL樣品于PAX小柱內,以流速0.3mL/min加壓過柱,然后依次以2mL去離子水,2mL甲醇淋洗,最后用1mL 5%(體積分數)的甲酸-甲醇溶液洗脫,洗脫液收集,經0.45μm微孔濾膜過濾后進行分析。

圖1結果顯示,水的提取效果最佳。乙醇提取的總酸峰面積雖然比較高,但是，8個峰無法實現良好分離,還產生了若干雜峰。然而，使用PAX小柱進行前處理,有機酸損失過多,可能由于這些有機酸的平均電離常數Ka較大。當樣品體積較大時,固相萃取才能起到富集的效果。鑒于文物樣品的體積有限，而且其中有機酸含量低的特點,PAX小柱前處理不宜用于文物樣品中的有機酸檢測。

圖1 3種提取方法的提取結果Fig.1 3 methods of extraction

2.2 方法驗證

2.2.1 紅外光譜法判別模型 選取了不同液體(第一大類A),包括牛奶、醋、醬油、芝麻油、黃酒;和不同酒液(第二大類B),包括白酒、米酒、啤酒、黃酒、葡萄酒,采集光譜樣本,分別提取41個和44個特征譜峰(見附表)。為了消除不同液體化學成分濃度差異影響判別效果,采用歸一化法處理,即將上述所選波長的吸光強度與1 645cm-1波數所對應的吸收強度做比值(所有液體樣品在1 645cm-1波數處均有紅外吸收),得到相對吸光強度。以特征峰的波數為自變量,相對吸光強度作為因變量,作為Fisher判別分析模型的判別指標,建立判別模型,如圖2。經過模擬老化的現代酒的殘留物紅外光譜結果代入模型，可以實現正確判別[13]。

2.2.2 有機酸檢測的標準曲線與線性關系 用8種有機酸的梯度濃度和其在210nm下檢測的不同強度響應值繪制標準曲線,線性相關系數(R2)為0.990 74～0.999 86,相關性良好,標樣回歸方程和線性范圍見表1。

圖 2 第一大類(A)和第二大類(B)的判別模型Fig.2 2 estimating model

編號物質平均保留時間/min線性回歸方程相關系數R2定量線性范圍/mg·mL-11草酸Oxalic acid, 99%2.85y=8 788 150.819 67x-264.147 540.993 180.000 50～0.250 00 2酒石酸L-(+)-Tartaric acid3.23y=1 307 759.836 07x+964.836 070.996 570.004 00～2.000 00 3丙酮酸Pyruvic acid3.75y=8 873 000.000 00x-63.000 000.996 440.000 60～0.300 00 4蘋果酸L-(-)-Malic acid4.18y=589 731.803 28x+646.508 200.995 850.010 00～5.000 00 5乳酸L-Lactic acid5.28y=332 420.655 74x-93.360 660.999 860.010 00～5.000 00 6檸檬酸Citric acid6.47y=766 685.901 64x-339.557 380.997 770.012 50～6.250 00 7富馬酸Fumaric acid7.63y=100 485 752.608 05x+2 449.393 440.990 740.000 22～0.110 00 8琥珀酸Succinic acid8.98y=418 926.229 51x-2 255.852 460.996 690.020 00～10.000 00

2.2.3 有機酸檢測的精密度實驗 對1%(體積分數)有機酸標準混合溶液進行連續5次分析,每次進樣記錄保留時間和峰面積,并計算相對標準偏差RSD,8種有機酸的RSD值在0.55%～1.31%之間,表明該方法精密度良好。由于樣品量有限,不進行重復性測試和回收率實驗。

2.3 實際樣品分析

2.3.1 樣品的紅外光譜判別 每個壓片平行測量3次,兩個樣品的光譜樣本均呈現良好的重復性。隨機選取M11∶2和M11∶5的各1條光譜樣品,選擇41個特征峰,歸一化處理后,作為預測集代入第一大類判別模型,如圖3。

圖3 第一大類樣品預測Fig.3 Samples in No.1 category

2個樣品點與酒的質心點最為接近,而與牛奶、醋、芝麻油和醬油的質心點有較遠的距離。

圖4為隨機選取的2條樣品光譜譜圖與現代黃酒的光譜譜圖。在1 390，1 650，1 172cm-13個波數下均有較強吸收,初步判定含有一定量的酸類、酯類或羰基化合物。

圖4 樣品和黃酒的紅外光譜譜圖Fig.4 Spectrogram of samples and yellow wine

再隨機選取M11∶2和M11∶5各1條光譜樣品,選擇44個特征峰,歸一化處理后,作為預測集代入第二大類判別模型,如圖5。2個樣品點均落入米酒和黃酒聚集的范圍內,與米酒和黃酒的組質心最為接近。

圖5 第二大類樣品預測Fig.5 Samples in No.2 category

通過紅外光譜識別,可以確定兩個液體樣品是酒類,而且指向中國古代的傳統糧食酒。

2.3.2 樣品的有機酸檢測 采用1.3節前處理方法對樣品進行前處理,并在1.4.2節所述的色譜條件下進行HPLC檢測。結果表明,在樣品中共檢測到7種有機酸,琥珀酸未檢測到。4個樣品在草酸保留時間范圍內(±3%)都出現了高峰,超出線性定量范圍,故未進行定量計算。3個樣品中檢測到乳酸,僅1個樣品中檢測到了酒石酸。樣品M11∶5L中檢測到的有機酸種類最多,M2∶6其次,說明酒的液態殘留物比固態殘留物保存有更多的有機酸,而且青銅器有蓋的情況更加利于酒殘留物的保存。出土酒殘留物中有機酸分析結果見表2。

4個樣品中僅1個檢測到酒石酸。酒石酸是葡萄酒的主體有機酸[9],若樣品是葡萄酒殘留物,則在乳酸尚能檢測到的情況下,酒石酸理應出現而且含量應為最高。所以，走馬梁酒殘留物原為葡萄酒的概率非常小。這與紅外光譜判別的結果相一致。

酒石酸是廣泛存在于植物中的一種有機酸。酒石酸的存在,證實了西漢時制作酒曲確實中會添加一些中草藥類植物。這與西晉嵇含的《南方草木狀》[14]和北魏賈思勰的《齊民要術》中記載的草曲制法相吻合[15]。中草藥類植物的加入,具有增加釀酒微生物的營養,抑制雜菌生長,促進微生物生長代謝與馴化的作用,并能產生特殊香味[16]。時至今日,制作黃酒小曲時仍然使用中草藥類植物[17]。中草藥類植物會向糧食酒中引入少量的酒石酸,此外,傳統方法制作的酒曲中除了用于糖化和酒化的優勢菌種,也有一部分產酸雜菌,其產物就包括酒石酸。酒石酸化學性質穩定,容易形成酒石酸鹽沉淀保留下來,在一定的條件變化下又還原成酒石酸。理論上講,酒石酸是殘留物中最有可能保留下來的物質之一。

3個樣品中檢測到乳酸,而且含量較其他有機酸更高。乳酸是糧食酒中(包括現代黃酒、米酒)的主體有機酸,糧食酒制作在制備酒母時,曲中的根霉、毛霉作用,能生成乳酸為主的酸,在酒化過程中乳酸桿菌和鏈球菌作用也能生成乳酸等有機酸[6]。

草酸也是糧食酒中重要的有機酸之一,含量僅次于乳酸[18],在谷物的浸泡,糖化和發酵過程中產生[19],通常以草酸鹽的形式存在。JiaJing WANG等人在使用離子色譜法(IC)對米家崖遺址陶器殘留物分析時檢測到草酸鹽的存在[5],認為這是樣品陶器與酒的發酵有關的證據之一。McGovern PE也多次在考古殘留物分析中檢測到草酸及其鹽,并作為酒的標記物之一[21-23]。本研究同樣檢測到了草酸,與前人的成果相合,但草酸作為酒的標記物在判斷釀酒主要原料時,指向性遜于酒石酸和乳酸。

樣品中檢測到的丙酮酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸4種有機酸在現代糧食酒中含量適中,通常低于或接近各自的閾值[8]。其具體含量隨廠家而異,比例無規律性關系[9,11,24-25],與走馬梁樣品的有機酸檢測結果相吻合。

表2 有機酸分析結果Tab.2 Analysis results of organic acids in wine residue

3 結 論

本研究通過對牛奶、醋、醬油、芝麻油、酒等各種古代常見食用液體紅外光譜的40余個特征峰進行歸一化處理,采用Fisher判別模型實現對上述液體(包括老化以后的液體)的初步區分。在初步區分的基礎上,通過高效液相色譜進一步對疑似酒殘留物樣品的有機酸含量進行檢測,根據殘留物中有機酸的種類和含量可以推測酒的類別及釀酒原料。

采用上述方法對陜西榆林走馬梁漢墓出土的殘留物進行分析。結果表明,走馬梁漢墓出土3件青銅器中的殘留物均為酒殘留物。這些酒是通過糧食釀造的發酵酒,釀酒的糧食種類目前無法判斷,還需進一步研究。漢代經過初期的休養生息,到漢武帝以后社會穩定,經濟發展,釀酒業比較興盛,這在漢墓的畫像石和畫像磚中均可以得到印證。范曄的《后漢書禮儀志下》載:東園武士執事下明器。筲八盛,容三升……甕三,容三升……載以木桁,覆以疏布。甒二,容三升,醴一,酒一。載以木桁,覆以功布……卮八……行方酒壺八……瓦酒樽二,容五斗[26]。這表明從《禮記》成書年代至漢代,隨葬酒的習俗一直被當作重要禮儀沿用。從現實層面來說,豐富的隨葬品象征著富足,避免死者在離世后遭受饑苦。同時,墓前祭祀是喪葬活動的一個重要環節,飲食類隨葬品在其中充當“道具”的角色。走馬梁漢墓不屬于高等級貴族墓葬[12],根據墓葬形制與器物判斷,屬于漢朝駐守邊塞區域的官員。在這些中層官吏的墓葬中發現酒殘留物,說明漢代以酒隨葬的習俗已經從貴族走向普通官員甚至普通百姓,也從側面證明了漢代釀酒業的發達。

本文建立的酒殘留物的分析方法能有效地適用于考古出土的酒殘留物的鑒定和檢測,通過對出土酒殘留物的系統檢測,可以深入研究中國釀酒技術的發展歷程及其與社會發展的關系。