黃芪多糖提取工藝優化及其抗氧化活性研究

胡碧君

（廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510400）

黃芪為豆科草本植物蒙古黃芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或 膜莢黃芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，性溫，味甘，有補氣升陽、利水消腫、補氣固表功效[1－2]。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，具有抗腫瘤、抗衰老、抗病毒、增強免疫力、促進免疫器官功能和抗體的生成、改善心血管功能、雙向調節血糖等作用[2－4]。目前黃芪多糖的提取方法為蒸餾水提取法，簡單易行，但提取率較低，且純度不高，使得提取成本過高，限制了其研究與開發。本試驗中應用微波輔助提取法提取黃芪多糖，利用響應面法優化其提取工藝，并研究了其體外抗氧化活性，以期找出更合理經濟的提取工藝，為黃芪的開發利用提供理論基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DSY－9002型戴生高速萬能粉碎機（永康市九順瑩商貿有限公司）；GHZ型微波萃取器（北京國環高科有限公司）；UV－8000A型紫外分光光度計（天津天光光學儀器有限公司）。

1.2 試藥

黃芪（Astragalus membranaceus）藥材飲片購于廣州濟和堂中藥店，經廣東藥科大學天然藥物化學教研室王定勇教授鑒定為黃芪；葡萄糖標準品（上海源葉生物科技有限公司，批號為 Z110833）；濃硫酸、苯酚等其他試劑（分析純）。

2 方法與結果

2.1 提取工藝流程

黃芪→粉碎→過篩→石油醚回流脫脂脫色2次（每次1 h）→烘干→微波輔助水提取→抽濾→濾液減壓濃縮→5倍體積 95% 乙醇沉淀12 h→5 000 r／min離心15 min→沉淀物→無水乙醇洗滌→水溶→Sevage法脫蛋白5次→冷凍干燥→多糖粗品[5－6]。

2.2 多糖含量測定（標準曲線繪制）

取葡萄糖標準品50 mg，加水溶解定容，置100 mL容量瓶中，作為母液備用。精密移取 0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 母液，定容于 50 mL 容量瓶中。分別取2 mL置試管中，分別加入6%苯酚1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，混勻，靜置10 min，冷卻至室溫，于490 nm波長處測定吸光度。以多糖質量濃度（X，g／L）為橫坐標、吸光度（Y）為縱坐標繪制標準曲線[7－8]，得回歸方程 Y＝15.676 X＋0.022 8，r＝0.999 7（n＝7），質量濃度線性范圍為 0.005 ～ 0.050 g／L。

2.3 微波提取工藝優化

2.3.1 單因素試驗

稱取2.0 g黃芪干粉若干份，分別選取液料比（因素 A，mL ／g）、提取時間（因素 B，h）、提取功率（因素 C，W）進行單因素試驗，分析對多糖提取率的影響。

液料比：在微波功率200 W、提取時間2 h的條件下提取，結果見圖1 A。液料比為10～30 mL／g時，黃芪多糖提取率隨提取溶劑體積的增加而增大，液料比為30 mL／g時提取率最高（8.54%）；隨著溶劑體積繼續增加，多糖提取率降低。原因可能是隨提取溶劑體積增大，多糖質量濃度越低，傳質推動動力越大，提取速率增加，提取率增大；當溶劑體積繼續增加達到一定程度時，提取率緩慢降低，可能是因為有大量的雜質溶出，影響多糖浸出率[9－10]。

圖1 不同因素對多糖提取率的影響

提取時間：在微波功率200 W、液料比30 mL／g的條件下提取，結果見圖1 B。0.5～2 h內，多糖提取率隨提取時間增加而增大，2 h時提取率最大（8.47%）；隨時間延長，多糖提取率不再增加。可能是因為延長提取時間可增加微波的反射與吸收，增強微波對黃芪的穿透效果，提高多糖的提取率[11－12]。提取時間達2 h后，提取過程達到動態平衡，多糖的提取率變化不大。

提取功率：在液料比30 mL／g、提取時間1 h的條件下提取，結果見圖1 C。100～150 W內，多糖提取率逐漸增加。其原因可能是該功率范圍內微波可輻射膨脹破裂的臨界內壓，微波破壁能力逐漸增強。當功率大于150 W后加快了提取溶劑的揮發，反而不利于黃芪多糖的提取[13]。

2.3.2 響應面法優化試驗

因素水平選擇：見表1。

表1 響應面試驗設計與結果

模型建立及顯著性分析：根據單因素試驗結果，以Box－Behnken試驗設計進行提取，以響應面法分析最佳工藝[14]。通過分析表1數據，得二元回歸方程 Y＝9.41＋0.19 A＋0.30 B ＋0.082 C －0.45AB ＋0.06 AC ＋0.046 BC － 1.05 A2－ 0.67 B2－ 0.53 C2。由表 2可知，液料比、提取時間一次項和二次項，提取功率二次項，液料比與提取時間的交互項 P＜0.05，說明對提取率有顯著影響。經顯著性檢測，該模型的相關系數 R2＝0.9784，說明該模型與實際試驗擬合較好，自變量與響應值線性關系顯著[15]。

表2 方差分析和顯著性檢驗結果

各因素間交互效應分析：等高線形狀可反映交互作用強弱。液料比與提取時間的等高線呈扁平狀(如圖2 A)，表明兩因素交互作用明顯；液料比與提取功率，以及提取時間與提取功率的等高線近似圓形(如圖2 B和圖2 C)，表明其交互作用對多糖提取率影響均較小。

提取工藝優化：通過分析試驗模型，得出黃芪多糖提取最優工藝參數為，液料比 30.46 mL／g，提取時間

圖2 各因素交互作用對黃芪多糖提取的響應面和等高線圖

2.2 1 h，提取功率 204.45 W。在此提取條件下，黃芪多糖提取率理論值為9.74%。

2.3.3 驗證試驗

采用優化提取條件進行工藝驗證試驗，測得多糖平均提取率為 9.69% ，結果的 RSD ＝1.03% （n＝3），與理論值相比，相對偏差較小，說明該模型可較好地預測各因素與黃芪多糖提取率間的關系。

2.4 抗氧化活性研究

DPPH·清除率測定：取系列質量濃度黃芪多糖溶液 2 mL，置試管中，加入質量濃度為 0.04 g／L的DPPH·溶液，混勻，靜置 30 min，以 5 000 r／min的速率離心10 min。測定上清液在517 nm波長處的吸光度。按公式，清除率 ＝1－[（A1－A2）／A0]×100%，計算DPPH·清除率[16]。其中 A0為空白組吸光度，A1為樣品組吸光度，A2為2 mL樣品溶液＋2 mL無水乙醇的吸光度。結果見圖 3 A 和圖 3 B。可見，在 0.5～2.0 g／L 質量濃度范圍內，黃芪多糖DPPH·清除率隨質量濃度的增大而增強，但質量濃度超過 2.0 g／L時再繼續增加，DPPH·清除能力變化不大。表明黃芪多糖具有一定的DPPH·清除活性，但比維生素C的DPPH·清除能力弱。

羥自由基清除率測定：依次向試管中加入濃度為6 mmol／L 的 H2O2溶液、9 mmol／L 的 FeSO4溶液、9 mmol／L的水楊酸 －乙醇溶液各1 mL，混勻，向其中加入1 mL質量濃度不同的多糖溶液。最后加6 mmol／L的H2O2啟動反應，37℃反應30 min，以蒸餾水為空白組，測定各組在510 nm波長處的吸光度。按公式，清除率＝[1－（Ax－ Ax0）／A0]×100% ，計算羥自由基清除率[17]。其中 A0為空白組吸光度，Ax為加樣品組吸光度，Ax0為不加顯色劑時H2O2樣品溶液的吸光度。結果見圖3 C和圖3 D。可見，黃芪多糖OH·清除率隨著質量濃度在0.5～2.5 g／L范圍內的增大而增強，具有較好的線性關系，其半數清除時的質量濃度為1.494 g／L。說明黃芪多糖有一定的OH·清除活性，但與維生素C的OH·清除能力相比要差。

圖3 黃芪多糖與維生素C的DPPH·及OH·清除率

3 討論

微波提取技術是指使用適合的溶劑在微波反應器中從天然藥用植物、礦物、動物組織中提取各種化學成分的技術和方法。它是通過微波加熱作用使得溫度急劇升高，水汽化產生的壓力將植物的細胞壁沖破，有利于細胞內多糖的釋放；同時借助于微波的電磁場，加速被萃取的植物成分向萃取溶劑界面擴散。微波輔助提取技術與現有其他提取技術相比優勢明顯，可有效地提取物料中的有用成分，對提取物具有高選擇性，并具有提取快、產率高、省時、耗能低、溶劑用量少、生產線組成簡單、節省投資、無污染等優點[18]。本研究中以微波輔助提取黃芪多糖，結果表明，此方法合理可行；同時，對其體外抗氧化活性進行了初步研究，可為黃芪多糖的研究與開發提供一定的理論依據。

提取制得的黃芪多糖具有一定的抗氧化活性，但與對照品相比偏弱。這可能與提取的黃芪多糖純度不高有關。通過微波輔助提取可能會將黃芪中的蛋白質、色素等物質提取出來，使得黃芪多糖的純度不純。對于黃芪多糖的純化以及組分的分離將作為下一步的研究工作。

本試驗在單因素試驗基礎上，將響應面法應用于優化黃芪多糖的提取，分析和驗證試驗結果表明，多糖提取的最佳工藝條件為液料比 30.46 mL／g，提取時間2.21 h，提取功率 204.45 W；在此條件下，多糖平均提取率為9.69%。提取的黃芪多糖具有一定的DPPH·和OH·自由基清除能力。本試驗優化得出的黃芪多糖提取工藝及其抗氧化活性初步研究，可為黃芪的研究與開發提供基礎。