板藍根特征圖譜及3種成分含量測定研究

殷世寧，張春輝 ，王海英

（1.山東省青島市食品藥品檢驗研究院，山東 青島 266071； 2.山東省青島市中心醫院，山東 青島 266061）

板藍根為十字花科菘藍屬植物菘藍 Isatis indigotica Fort.的干燥根，性寒，味苦，歸心、胃經，具有清熱解毒、涼血利咽之功效，用于治療瘟毒發斑、舌絳紫暗、痄腮、喉痹、大頭瘟疫、爛喉丹痧、丹毒、癰腫等[1]，主要分布于我國江蘇、浙江、福建、河南等地。板藍根在我國應用歷史悠久，《神農本草經》上品欄中已有“藍實”記載。現今，板藍根制劑用量之大，堪稱中藥之最，已報道的板藍根化學成分有吲哚類、喹唑酮類、喹啉類、芥子苷類、含硫類、有機酸類、氨基酸類和甾醇類[2]，其現行質量標準收載于2015年版《中國藥典（一部）》，但僅對板藍根的性狀、顯微特征、水分、灰分、浸出物、（R，S）－告依春含量測定等進行了控制，質控方法較單一。為了更全面地控制板藍根的質量，本研究中參考了2015年版《中國藥典（四部）》[3]及文獻[4 － 9]，采用高效液相色譜（HPLC）法建立了板藍根的特征圖譜，并對15個特征峰進行標定，同時對板藍根中尿苷、腺苷、（R，S）－告依春的含量進行測定。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC－20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；BP211D型電子天平（精度 0.01 mg，德國 Sartorius公司）；AUTO Science AS10200BT型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

尿苷對照品（批號為887－200202，含量為100%），腺苷對照品（批號為110879－200202，含量為100%），（R，S）－告依春對照品（批號為 111753－201505，含量為100%），均購自中國食品藥品檢定研究院；18批板藍根（S1～S18）產地信息見表1；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

表1 18批供試品相對保留時間測定結果

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：AgilentEclipsePlusC18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 － 0.05% 磷酸溶液，梯度洗脫（0～10 min時0.05%磷酸溶液 98%→80%，10～30 min時0.05%磷酸溶液80%→40%，30～35 min時0.05%磷酸溶液 40%→ 20%，35～40 min時 0.05%磷酸溶液：20%→ 40%，40～45 min時 0.05%磷酸溶液40%→ 98%，45～50 min時 0.05%磷酸溶液 98%）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。理論板數按（R，S） －告依春峰計應不低于10 000。

2.2 溶液制備

精密稱取尿苷對照品18.57mg、腺苷對照品17.28mg、（R，S）－告依春對照品 20.27 mg，分別置 50 mL 容量瓶中，加水定容至50 mL，制成對照品貯備液。分別精密量取尿苷、腺苷對照品貯備液各1 mL，（R，S）－告依春對照品貯備液5 mL，置25 mL容量瓶中，加水定容至25 mL，制 成 每 1 mL 含 尿 苷 14.856 μg、腺 苷 13.824 μg、（R，S）－告依春 81.080 μg的混合溶液，即得混合對照品溶液。取板藍根樣品粉末（過 4號篩）0.2 g，精密稱定，精密加水10 mL，稱定質量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱定質量，加水補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 特征圖譜測定

共有特征峰標定：分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定50 min，記錄42 min色譜圖，并以國家藥典委員會2012.130723版中藥色譜特征圖譜相似度評價系統進行計算，生成板藍根的特征圖譜，從中選定共有特征峰15個。通過比較混合對照品溶液及供試品溶液，并結合DAD光譜，得出供試品溶液圖譜中15個共有特征峰，其中3號峰為尿苷，4號峰為腺苷，6號峰為（R，S）－告依春。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗：按2.1項下色譜條件，精密吸取同一供試品溶液（S1）10 μL，連續進樣 6次，測定共有特征峰15個，以（R，S）－告依春峰作為參照峰（S峰），計算各特征峰與S峰的相對保留時間。結果的 RSD＜1.5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批樣品（S1），按 2.2項下方法制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別進行測定，測定共有特征峰15個，計算各特征峰與S峰的相對保留時間。結果的 RSD＜1.5%（n＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液（S1），按2.1項下色譜條件，分別于 0，1，8，12，24，36 h 時進樣，測定共有特征峰15個，計算各特征峰與S峰的相對保留時間。結果的 RSD＜1.5%（n＝6），表明供試品溶液在 36 h內穩定性良好。

相對保留時間確定：采用上述色譜方法分析6批次板藍根樣品（S6，S7，S9，S10，S15，S16），以（R，S） － 告依春峰作為參照峰（S峰），各共有特征峰相對保留時間平均值分別為 0.304，0.332，0.604，0.683，0.799，1.000，1.120， 1.228，1.335，1.383，1.595，1.897，2.025，2.754，2.884，RSD 分別為 0.3% ，0.4% ，0.3% ，0.3% ，0.3% ，0，0.2% ，0.2% ，0.2% ，0.1% ，0.6% ，0.1% ，0.8% ，0.1% ，0.1% （n ＝ 6），允許范圍按 ± 5% 計算，各色譜峰相對保留時間均在規定范圍內。

特征圖譜測定結果：對18個樣品進行特征圖譜分析，計算相對保留時間。結果見表1。可見，18個樣品的15個特征峰相對保留時間均無明顯偏差，符合規定限度。

2.4 指標性成分含量測定

2.4.1 方法學考察

線性關系考察：分別精密吸取混合對照品溶液1，3，5，10，15，20 μL，按 2.1 項下色譜條件測定，以峰面積積分值(Y)為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標繪制標準曲線。尿苷、腺苷、（R，S）－告依春的回歸方程分別 為 Y＝2.57×106X－5.00×101（r＝0.999 9）， Y＝3.14 ×106X＋9.26×102（r＝1.000 0）， Y＝2.91×105X＋6.64 × 102（r＝0.999 9），線性 范 圍 分別 為 0.014 9 ～0.2971 μg，0.013 8 ～ 0.276 9 μg，0.081 1 ～ 1.621 6 μg，上述各成分進樣量在相應線性范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

精密度試驗：按2.1項下色譜條件，精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續進樣6次。結果尿苷、腺苷、（R，S）－告依春峰面積積分值的 RSD分別為 0.08%，0.05%，0.03%（n ＝ 6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批樣品（S1），按2.2項下方法制備6份供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進行測定。結果尿苷，腺苷，（R，S）－告依春峰面積積分值的RSD 分別為 0.01% ，0.02% ，0.13% （n ＝ 6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液（S1），按2.1項下色譜條件，分別于 0，1，8，12，24，36 h 時進樣。結果尿苷、腺苷、（R，S）－告依春的峰面積積分值的 RSD均為0.01%(n＝6)，表明供試品溶液在36 h內基本穩定。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批樣品（S1）粉末（過4號篩）0.1 g，精密稱定，分別精密加入尿苷、腺苷、（R，S）－告依春對照品溶液 3，2，5 mL[對照品溶液質量濃度尿苷為 14.856 μg ／mL，腺苷為 13.824 μg ／mL，（R，S） － 告依春為 81.080 μg／mL]，按 2.2 項下方法制成供試品溶液，精密吸取 10 μL，按 2.1項下色譜條件進行測定，計算回收率。結果見表2。

2.4.2 樣品含量測定

取18批板藍根樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按2.1項下色譜條件進行測定。結果見表3。

3 討論

本研究中參考文獻[1，4－6]，比較了加水煎煮、加水回流提取、加水超聲提取的方法，發現采用加水超聲提取的特征圖譜效果最佳，色譜峰數量較多，且峰高優勢較明顯。試驗數據表明，采用加水超聲提取的方法對（R，S）－告依春的提取率明顯高于加水煎煮的方法，原因可能為加水煎煮導致板藍根的淀粉糊化，影響了（R，S）－告依春的提取。

表2 加樣回收試驗結果（n＝6）

表3 樣品含量測定結果（%，n＝3）

對板藍根中各化學成分采用等度洗脫方法難以達到滿意的分離效果，故考慮采用梯度洗脫。本研究中參考文獻[4－9]，分別考察了甲醇－0.1%甲酸溶液、甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0.05%磷酸溶液不同比例的流動相，并對梯度比例進行了研究，最終選擇文中的流動相，分離效果最好，樣品中各特征峰與其他組分峰基本可達基線分離。

目前，采用多成分含量測定法控制中藥的質量已成為一種檢測趨勢[10－11]。本研究中通過采用所建立的特征圖譜色譜評價系統，對18批次樣品進行測定，結果18批次樣品均檢出15個特征峰。板藍根中化學成分復雜，本研究中對板藍根中尿苷、腺苷、（R，S）－告依春3種成分同時進行測定，指標成分（R，S）－告依春為0.034～0.347% ，腺 苷 為 0.001～0.079% ，尿 苷 為0.010～0.051%，可為板藍根的質量控制提供參考。