高效液相色譜法測定追風傘提取物中5種酚酸類成分含量

陳 婷，徐加兵

（江蘇省揚州市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 揚州 225000）

追風傘為報春花科植物狹葉落地梅 Lysimachia paridiformis Franch.Var.stenophylla Franch.的 全 草 或根，又名驚風傘、公接骨丹、背花草、燈臺草等，主要分布于我國四川、廣西、貴州，云南等地，味苦、辛，性溫，無毒，有祛風通絡、活血止痛功效，以及抗炎、抗風濕[1－3]和抗氧化[4]等藥理作用，常用于治療風濕痹痛、半身不遂、小兒驚風、跌打及骨折等[5]，亦常與其他藥材組成復方制劑（巴布劑、凝膠劑、膠囊等）用于治療風濕關節炎等引起的疼痛[6－8]。追風傘的主要成分為黃酮類、甾醇類、脂肪酸類及揮發油類化合物[9－12]，目前，我國學者主要對追風傘的黃酮類化合物提取工藝進行研究[13－14]。本研究中以追風傘提取物中綠原酸、蘆丁、異鼠李素－3－O－β－D－葡萄糖苷、木犀草素、刺槐素為測定指標，采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定追風傘提取物中上述5種活性成分的含量，為追風傘有關的新藥及保健產品的開發提供試驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20A型液相系統（日本島津株式會社）；N2000型雙通道色譜站（浙江大學智能信息工程研究所）；RE5299型旋轉蒸發儀（上海雅東玻璃制品有限公司）；TopPette型微量移液器（大龍興創實驗儀器＜北京＞有限公司）；KH3200型超聲清洗機（寧波恒大超聲設備有限公司）；MS205型電子天平（梅特勒－托利多國際有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號為110753－201716），蘆丁對照品（批號為100416－201607），木犀草素對照品（批號為111520－201605），均購自中國食品藥品檢定研究院；異鼠李素－3－O－β－D－葡萄糖苷對照品（上海純優生物科技有限公司，批號為 P201703）；刺槐素（上海遠慕生物科技有限公司，批號為P201606）；追風傘藥材（亳州吉貝爾現代中藥飲片科技有限公司贈送，廣西產，由本中心房克慧主任鑒定為報春花科植物狹葉落地梅Lysimachia paridiformis Franch.Var.stenophylla Franch.的全草或根；追風傘提取物（自制，批號分別為20170816，20170824，20170905）；甲醇（色譜純，美國天地有限公司）；純化水（杭州娃哈哈集團有限公司），其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A） － 0.2% 醋酸水溶液（B），梯度洗脫(0～17 min時10%A→42%A，17～25 min時42%A→60%A，25～40 min時 60%A→90%A)；流速：1 mL ／min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：334 nm。

2.2 溶液制備

對照品溶液：精密稱取綠原酸、蘆丁、異鼠李素－3－O－β－D－葡萄糖苷、木犀草素和刺槐素對照品適量，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成質量濃度分別為 330.6，515.2，318.4，348.2，287.4 mg ／L 的對照品貯備液。

供試品溶液：稱取經干燥并粉碎過40目的追風傘藥材適量，加12倍量純化水回流提取1次，收集提取液，再將藥材殘渣用8倍量純化水回流提取2次，收集提取液，過150目篩，合并上述3次提取液，加95%乙醇醇沉至含醇量為50%，12 h后離心去沉淀，收集上清液，減壓濃縮。濃縮液上樣HPD400大孔吸附樹脂，依次用2倍柱體積純化水和2倍柱體積20%乙醇洗脫，以除去無機鹽、水溶性及部分醇溶性雜質，再用70%乙醇洗脫4倍柱體積，收集洗脫液，濃縮并真空干燥，干燥提取物粉碎并置密封袋中保存備用。使用時稱取追風傘提取物約100 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用70%乙醇超聲溶解并定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學考察

專屬性考察：精密量取2.2項下兩種溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣，得HPLC色譜圖，詳見圖1。可見，在該色譜條件下，5種成分的分離度均良好。

線性關系考察：精密吸取2.2項下混合對照品貯備液適量，制成系列質量濃度的混合對照品溶液。按2.1項下色譜條件進樣分析，以峰面積（A）對對照品質量濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程，詳見表1。

精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液，重復進樣6次，分別記錄峰面積。結果見表2，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：稱取追風傘提取物（批號為20170816）6份，每份約100 mg，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，計算含量。結果見表2，表明方法重復性良好。

表1 線性關系考察結果(n＝6)

表2 精密度、重復性、穩定性試驗結果

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，分別于 0，1，3，6，9，12，18，24 h時進樣測定，記錄峰面積。結果見表2，表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗：稱取已知含量的追風傘提取物（批號為20170816）6份，每份約50 mg，精密稱定，加入3 mL綠原酸、蘆丁、異鼠李素－3－O－β－D－葡萄糖苷、木犀草素和刺槐素 質量濃度分別為 41.325，64.400，39.800，43.525，35.925 mg ／L 的混合對照品溶液，置10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，經0.45 μm微孔濾膜濾過后進樣，計算峰面積。結果見表3。

2.4 樣品含量測定

精密稱取3批次追風傘提取物，每批約100 mg，制備3份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣，記錄峰面積，分別計算含量。結果見表4。

3 討論

3.1 色譜條件選擇

檢測波長[15－17]：通常根據各個待測成分的紫外吸收情況，綜合選擇一個各成分均具有較好吸收的波長作為檢測波長。紫外全波長掃描結果顯示，最大吸收波長綠原酸為253 nm和326 nm，蘆丁為258 nm和361 nm，異鼠李素－3－O－β－D－葡萄糖苷為255nm和353 nm，木犀草素為255 nm和350 nm，刺槐素為334 nm。綜合考慮，選擇334 nm作為檢測波長。

流動相：乙腈－水和甲醇－水為常用流動相體系，一般添加酸提高分離度和改善峰形[18－20]。本研究中嘗試采用乙腈－水、甲醇－水等度系統不同比例流動相分別對綠原酸、蘆丁、異鼠李素－3－O－β－D－葡萄糖苷、木犀草素和刺槐素5種成分進行分離，結果2種等度系統均不能使各成分很好地分離，且保留時間亦相對較長，故在此基礎上采用乙腈－水、甲醇－水梯度洗脫對各成分進行洗脫分離，結果甲醇－水梯度洗脫對各成分的分離度要優于乙腈－水梯度洗脫，且加入0.2%醋酸調整峰形。

柱溫：嘗試采用不同柱溫（25，30，35℃）考察對各成分分離度的影響，結果顯示，在30℃時色譜基線較平穩，且分離度較25℃和35℃好，故最終選擇柱溫為30℃。

表3 加樣回收試驗結果(n＝6)

表4 追風傘提取物中5種活性成分含量(n＝3)

3.2 方法評價

本研究中建立的HPLC法可同時測定追風傘提取物中綠原酸、蘆丁、異鼠李素 －3－O－β－D－葡萄糖苷、木犀草素和刺槐素的含量，且快速、準確、重復性好，可用來評價和控制追風傘提取物的質量，并為追風傘相關產品的開發提供試驗依據。