復原再造合劑質量標準研究

唐斌斌 ，杜書君 ，苑學明 ，李建勇，郝保華

（1.山東省聊城市陽谷縣人民醫院，山東 聊城 252300； 2.西北大學生命科學學院，陜西 西安 710069）

復原再造合劑是臨床常用且療效確切的經驗方，由三七、白芍、菊花、丹參、水蛭和鉤藤等組方，具有活血通脈、化瘀通絡功效，用于治療中風恢復期瘀血證（癥見半身不遂、行步艱難、偏身麻木、口眼歪斜、言語不利、苔暗脈數等）有良好效果。明代李中梓《醫宗必讀卷十·痹》中言“治風先治血，血行風自滅”，順其推理，“血行”就是“通”，瘀血行，經絡通，則中風病自愈，達到“風自滅”的目的[1]。復原再造合劑以“通”為組方原則，諸藥合用可祛除病癥，且服用安全，未見明顯不良反應。為了確保其質量穩定性和臨床有效性，本研究中對其進行了質量標準研究，建立了制劑中主要藥味三七、白芍和菊花的薄層色譜鑒別方法，以及丹參中丹酚酸B的含量測定方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilengt 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；YP－5001型電子精密天平（上海良平儀器儀表有限公司）；YFX20／3＋1型常壓循環 3＋1一體煎藥機（北京東華原醫療設備有限責任公司）；QH－2型夾層鍋（郭店前中不銹鋼制品廠）；BSA224S型電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）。

1.2 試藥

人參皂苷 Rg1對照品（批號為 110703－201530），人參皂苷 Rb1對照品（批號為 110704－201424），三七皂苷R1對照品（批號為110745－201318），芍藥苷對照品（批號為 110736－201539），綠原酸對照品（批號為110753－201415），丹酚酸 B對照品（批號為 111562－201514），購自中國食品藥品檢定研究院；復原再造合劑（批號分別為 20160606，20160609，20160615，醫院制劑室生產）；乙腈和磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純，試驗用水為雙蒸水。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別[2]

三七[3－6]：取本品 40 mL，加水飽和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的水洗2次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，殘渣加乙醇3 mL使溶解，作為供試品溶液。取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品及三七皂苷R1對照品，分別加甲醇制成質量濃度為1 g／L的溶液，作為對照品溶液。另取缺三七的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國藥典（四部）》通則0502，以下簡稱“通則 0502”]試驗，吸取上述5種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13∶7∶2）10℃以下放置分層的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

白芍[3－4，7]：取前述供試品溶液，裝在中性氧化鋁柱（200 目，2 g，內徑 8 ～10 mm，干法裝柱）上，用乙酸乙酯 －甲醇（1∶1）50 mL溶液洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為新的供試品溶液。取芍藥苷對照品，加甲醇制成質量濃度為2 g／L的溶液，作為對照品溶液。另取缺白芍的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述3種溶液各8 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，置105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

菊花[8－10]：取本品 30 mL，用稀鹽酸調 pH 至 2～3，加乙酸乙酯提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取綠原酸對照品，加甲醇制成質量濃度為1 g／L的溶液，作為對照品溶液。另取缺菊花的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述 3種溶液各4 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

圖1 薄層色譜圖

2.2 丹酚酸B含量測定（高效液相色譜法）

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 － 0.1% 磷酸溶液（30 ∶70）；檢測波長：286 nm；流速：1.0 mL ／min；柱溫：25 ℃，進樣量：10 μL。理論板數按丹酚酸B峰計應不低于2 000。

2.2.2 溶液制備

取丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加甲醇－水（8 ∶2）混合溶液制成每 1 mL 含 150.2 μg 的溶液，即得對照品溶液。精密量取本品2 mL，置50 mL容量瓶中，加 80% 甲醇 40 mL，超聲（150 W，40 kHz）處理 5 min，加80%甲醇至刻度，搖勻，過濾，濾液經0.22 μm濾膜濾過，即得供試品溶液。取缺丹參藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別取丹酚酸B對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣，記錄色譜峰。結果供試品溶液色譜和丹酚酸B對照品溶液色譜在相同保留時間處有色譜峰，陰性對照品溶液色譜在此保留時間處無色譜峰，陰性對照無干擾，且分離度較好，表明方法專屬性強。色譜圖見圖2。

線性關系考察：精密量取丹酚酸B對照品溶液2，4，8，10，15 μL，按擬訂色譜條件分別進樣測定，以丹酚酸 B進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程 Y＝364 198 X＋1 904.2，r＝0.999 9（n＝5）。結 果表明，丹 酚酸 B 進 樣量在0.300 ～ 2.253 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

圖2 高效液相色譜圖

精密度試驗：精密吸取質量濃度為 150.2 μg／mL的丹酚酸B對照品溶液10 μL，重復進樣6次，測定峰面積。結果的 RSD為0.82%（n＝6），表明儀器精密度好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液（批號為20160606），分別于 0，2，4，8，12，24 h 時進樣，測定峰面積。結果的RSD為1.24%（n＝6），表明供試品溶液在24h內穩定。

重復性試驗：取同一批樣品（批號為20160606），依法制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件測定峰面積，計算丹酚酸B含量。結果的 RSD為 0.78%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取丹酚酸B對照品6.82 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加甲醇－水（8∶2）溶液溶解，定容至刻度，搖勻，得質量濃度為0.341 mg／mL的對照品貯備液。量取已知含量（丹酚酸B質量濃度為3.431 mg／mL）的樣品 6 份，每份 0.3 mL，置容量瓶中，分別精密加入丹酚酸B對照品貯備液各3 mL，依法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 丹酚酸B加樣回收試驗結果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，依擬訂色譜條件進樣，測定含量。結果批號為20160606，20160609，20160615的3批樣品中丹酚酸B的含量分別為 3.422，3.559，3.453 mg ／mL。

3 討論

薄層色譜定性鑒別中，參考《中國藥典》及有關文獻，曾對制劑中的主要藥味進行研究，其中三七、白芍、菊花和丹參的薄層色譜鑒別斑點清晰，陰性對照無干擾。鑒別試驗中，因為三七和白芍的主要成分均為苷類，為使鑒別方法簡便、快捷，曾嘗試采用同一方法制備兩者的供試品溶液，結果三七的斑點較清晰，而白芍的分離度較差，適當處理后，效果良好。由于已對丹參中主要活性成分丹酚酸B進行了含量測定，為了避免重復，故制劑的質量標準未保留丹參的薄層色譜鑒別。

丹參為制劑中主要藥味，且用量較大，丹酚酸B是丹參水溶性提取物中含量最高、活性最強的有效成分，具有抗心肌缺血、抗血栓、改善微循環等作用[11]，故本研究中以丹酚酸B作為含量測定的指標成分。供試品溶液制備中，考察了不同體積分數甲醇的提取處理效果，結果以80%甲醇超聲處理5 min的效果較佳，此后即使超聲時間加長，樣品含量也基本無變化。試驗中曾選用了乙腈 － 1% 甲酸溶液（40 ∶60）[12]、甲醇 － 0.1% 磷酸（32 ∶68）[13]、乙腈 －水 －磷酸（23 ∶77 ∶0.1）[14]、甲醇 －乙腈 －甲酸 －水（30∶10∶1∶59）[15]等流動相系統，結果色譜峰分離程度均未達到理想效果。經多次試驗，適當調整后，最終采用乙腈 －0.1%磷酸溶液（30∶70）流動相時，所得色譜圖中待測成分與雜質分離較好，陰性對照無干擾，經方法學驗證，效果較滿意。