阿德福韋酯聯合干擾素 －2b對慢性乙型肝炎患者細胞免疫與趨化因子水平的影響

賀 旭，柴 進，劉 巍

（1.中國人民解放軍第九五八醫院，重慶 400020； 2.陸軍軍醫大學附屬西南醫院消化內科，重慶 400038）

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）為我國常見傳染病[1]，以肝細胞炎癥性壞死為主要病理特征，患者常出現乏力、納差、惡心、腹脹、肝區疼痛等癥狀，可進展為肝硬化、肝癌、肝功能衰竭，也能引起全身多個臟器受損[2－3]。治療 CHB的關鍵在于抑制乙型肝炎病毒(HBV)的復制和體內對HBV的免疫反應，從而控制病情進展。阿德福韋酯（ADV）和干擾素是常用治療CHB的藥物，兩者各有優缺點，前者屬核苷（酸）類似物，其對HBV DNA的陰轉率較高，但HBeAg的轉換率較低，而后者對HBeAg的轉換率較高，HBV DNA的陰轉率較低，故臨床常將兩者聯用。以往的研究[4－5]主要關注這2種藥物的臨床療效，對其細胞免疫水平與趨化因子的表達水平影響研究較少。本研究中選取醫院2015年收治的CHB患者96例，進行分組治療，觀察了治療前后的細胞免疫水平與各種趨化因子的變化。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標準：符合2000年西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》中CHB的診斷標準[6]；HBeAg陽性至少1 年，HBV DNA 載量 ＞1.0×105copies／mL，血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）水平 80～400 U／L，血總膽紅素(TBil)＜正常值上限的2倍，血小板（PLT）計數＞80×109／L，凝血功能正常；治療前6個月未使用抗病毒藥物與免疫調節劑；能完成至少48周的療程，臨床資料完整、可靠；本研究獲得我院醫學倫理委員會批準，患者自愿參加本研究，且簽署知情同意書。

表1 3組患者一般資料比較(n＝32)

排除標準：合并肝硬化、肝性腦病、肝癌；合并甲型、丙型、丁型等其他肝炎病毒或EB病毒、巨細胞病毒等感染；合并嚴重的心、肺、腎、內分泌、血液、神經精神等系統疾病或惡性腫瘤；妊娠期或哺乳期。

病例選擇與分組：選取醫院2015年1月至12月收治的CHB患者96例，其中男87例，女9例；年齡26～60 歲，平均（37.4±5.3）歲。按隨機數字表法將96 例患者分為ADV組、干擾素組和聯合組，各32例。3組患者的一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。詳見表1。

1.2 治療方法

全部患者均給予常規生活指導。ADV組患者應用阿德福韋酯膠囊（正大天晴藥業集團股份有限公司，國藥準字H20060666，規格為每粒10 mg），口服，每日1次，每次10 mg；干擾素組患者應用重組人干擾素α－2b注射液（安徽安科生物工程＜集團＞股份有限公司，國藥準字S20040010，規格為每支 600萬 U），隔日皮下注射1次，每次600萬U；聯合組患者同時應用2種藥物，其用法、用量同其他兩組。3組患者療程均為48周，治療期間進行隨訪，停藥后繼續隨訪24周，共72周。治療期間定期檢測患者血常規、血生化與凝血功能等指標。

1.3 觀察指標

臨床療效與安全性：分別于治療后24周、48周、72周時評價臨床療效，包括血常規、肝腎功能、HBVDNA載量、HBV兩對半等，記錄各個時間點有無HBV DNA 陰轉（＜5×102copies／mL）、HBeAg陰轉與 ALT復常（≤40 U／L），以及治療期間有無不良反應發生，包括發熱、乏力、肌肉與關節酸痛、脫發、PLT降低、腎功能損害等。

細胞免疫水平：分別于治療前，治療后24周、48周、72 周時檢測 T 淋巴細胞亞群，包括 CD3＋，CD4＋，CD8＋的表達情況，具體操作為在 0.1 mL全血中加入 20 μL三色熒光抗體，室溫靜置0.5 h后采用流式細胞術檢測。并檢測T淋巴細胞組織中核仁組織區嗜銀蛋白（AgNORs）含量，具體操作為采集外周靜脈血8 mL，全血分離出淋巴細胞，然后進行培養、繁殖與染色，檢測并對圖像進行分析[7]。

趨化因子水平：分別于治療前，治療后24周、48周、72周時采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測外周血趨化因子 CXCL9，CXCL11，CCL20水平，試劑盒由伊萊瑞特生物科技有限公司提供，嚴格按照說明書進行操作。

1.4 統計學處理

采用SPSS18.0統計學軟件分析。計量資料以均數±標準差（s）表示，行 t檢驗，多組比較采用方差分析，然后進行兩兩比較；計數資料以率表示，行 χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

結果見表2至表4。ADV組未出現1例不良反應；干擾素組共出現28例（87.50%）不良反應，包括23例發熱、乏力與肌肉關節酸痛，5例脫發；聯合組共出現26例（81.25%）不良反應，包括20例發熱、乏力與肌肉關節酸痛，5例脫發，1例PLT一過性減少。均未發生嚴重不良反應，未影響繼續治療，全部完成規定療程。ADV組的不良反應發生率顯著低于另兩組（P＜0.05）。

表2 3組患者各時間點臨床療效比較[例（%），n＝32]

表3 3組患者T淋巴細胞亞群分布與AgNORs含量比較（s，n＝32）

表3 3組患者T淋巴細胞亞群分布與AgNORs含量比較（s，n＝32）

注：與本組治療前相比， P ＜0.05；與干擾素組相比，aP ＜0.05；與聯合組相比，bP ＜0.05。表 4 同。

時間治療前治療后24周治療后48周治療后72周組別ADV組干擾素組聯合組2／F 值P值ADV組干擾素組聯合組2／F 值P值ADV組干擾素組聯合組2／F 值P值ADV組干擾素組聯合組2／F 值P值CD3＋(%)64.30 ± 10.60 65.10 ± 9.80 66.00 ± 10.20 0.55 0.58 66.80 ± 6.50 68.00 ± 6.10 69.80 ± 5.80 2.39 0.09 68.00 ± 5.90b 70.70 ± 6.20 72.20 ± 5.50 4.00 0.02 67.30 ± 6.60b 69.50 ± 6.00 71.30 ± 5.90 3.56 0.03 CD4＋(%)33.30 ± 7.80 34.00 ± 7.20 34.30 ± 7.60 0.33 0.71 35.10 ± 7.90 37.10 ± 8.50 38.30 ± 8.90 1.68 0.19 36.30 ± 8.60b 39.20 ± 9.00 41.60 ± 9.20 3.90 0.02 35.80 ± 8.20b 38.50 ± 8.30 41.10 ± 9.00 3.52 0.03 CD8＋(%)32.50 ± 7.60 31.80 ± 7.80 31.30 ± 8.00 0.20 0.81 30.30 ± 7.90 29.30 ± 7.50 28.10 ± 8.20 1.77 0.17 27.80 ± 8.50 25.50 ± 8.30 23.70 ± 8.60 2.78 0.06 28.30 ± 7.90 26.70 ± 7.80 24.30 ± 8.50 2.55 0.08 CD4＋ ／CD8＋1.03 ± 0.22 1.07 ± 0.20 1.10 ± 0.19 1.28 0.28 1.16 ± 0.26b 1.27 ± 0.26 1.36 ± 0.27 4.22 0.01 1.31 ± 0.36 ab 1.54 ± 0.33 b 1.76 ± 0.35 5.07 0.00 1.27 ± 0.37b 1.44 ± 0.35b 1.69 ± 0.40 4.81 0.01 AgNORs含量(%)4.08 ± 1.22 4.17 ± 1.36 3.98 ± 1.30 0.29 0.74 5.51 ± 1.28 5.78 ± 1.35 6.01 ± 1.43 1.11 0.33 6.92 ± 1.35b 7.33 ± 1.39 7.72 ± 1.43 3.39 0.03 6.49 ± 1.30 6.99 ± 1.33 7.15 ± 1.38 2.80 0.06

表 4 3組患者血趨化因子水平比較（s，pg／mL，n＝32）

表 4 3組患者血趨化因子水平比較（s，pg／mL，n＝32）

時間治療前治療后24周治療后48周治療后72周組別ADV組干擾素組聯合組t／F 值P值ADV組干擾素組聯合組t／F 值P值ADV組干擾素組聯合組t／F 值P值ADV組干擾素組聯合組t／F 值P值CXCL9 2 355.8 ± 92.6 2 365.8 ± 88.8 2 379.7 ± 95.6 1.01 0.36 1 619.0 ± 166.6 ab 1 516.8 ± 170.1 b 1 413.6 ± 155.8 6.81 0.00 1 173.3 ± 125.8 ab 1 086.8 ± 118.2 b 1 001.8 ± 109.7 9.55＜ 0.01 1 323.6 ± 131.8 ab 1 243.0 ± 120.8 b 1 166.9 ± 115.6 8.23＜ 0.01 CXCL11 218.9 ± 43.3 222.2 ± 45.6 232.6 ± 39.8 1.25 0.29 181.6 ± 33.9 b 170.3 ± 36.1 155.5 ± 32.3 3.65 0.03 155.0 ± 31.1 ab 136.9 ± 29.1 b 120.7 ± 25.5 7.00＜ 0.01 168.6 ± 33.9 ab 148.8 ± 30.6 b 131.3 ± 28.8 5.55＜ 0.01 CCL20 139.9 ±35.7 145.1 ± 38.2 142.0 ±40.1 0.66 0.51 111.8 ±36.7 b 99.7 ± 35.6 88.9 ±32.1 3.53 0.03 98.2 ±27.3 b 88.5 ± 28.1 b 72.9 ±26.7 4.33 0.01 101.6 ±32.1 b 91.8 ± 29.0 78.9 ± 27.8 3.99 0.02

3 討論

ADV聯合干擾素α－2b治療CHB是臨床常用治療方案，2種藥物各有優缺點，有互補作用，療效顯著。本研究結果表明，經過48周完整的治療后，3組患者的整體療效較理想，ADV與干擾素 α－2b 2種藥物對CHB患者的生化學應答效果均非常明顯，ALT復常率與兩者聯用后無明顯差異。ADV治療后患者的病毒學應答效果顯著，但血清學應答效果很差。與ADV相反，干擾素α－2b對CHB患者的血清學應答效果較明顯，但病毒學應答效果很差。兩者聯用后同時提高了病毒學與血清學應答效果，HBV DNA陰轉率、HBeAg陰轉率、HBeAb陽轉率均優于單用藥物組患者，且停藥后能維持半年，三者的比例分別為93.8%，62.5%和53.1%，較停藥時無明顯降低，提示療效能在短期內維持，不需要終身服藥，與以往研究結果[5]類似。但以往的研究并未觀察3個治療方案對CHB患者細胞免疫水平與趨化因子的表達差異。

人體內 T 細胞主要由 CD3＋，CD4＋，CD8＋3 個亞群組成，其亞群數量與比例是維護體內細胞免疫穩定的關鍵。目前認為，乙型肝炎的發生、發展與機體的細胞免疫功能狀態息息相關，其中T淋巴細胞起關鍵作用，具體表現為T淋巴細胞數量及亞群比例失調，是HBV在體內持續進行復制的重要原因之一，在乙型肝炎慢性化過程中發揮重要作用。當機體感染HBV后，體內會出現特異性的T淋巴細胞，以此清除細胞內病毒，當發生急性自限性的HBV感染時，體內有較強的特異性T淋巴細胞反應。但對于CHB患者，其T淋巴細胞的反應較弱，甚至難以檢測到，故促進體內細胞免疫水平有助于控制疾病進展，這也是當前抗病毒藥物的藥理作用機制之一。ADV是核酸類似物，其通過抑制HBV DNA的多聚酶來抑制病毒繁殖，且能誘導體內干擾素的合成，增加NK細胞活力，刺激體內免疫反應，從而起到較強的抗病毒作用。體外注射干擾素不僅能抑制病毒的復制及病毒相關蛋白的表達，還能誘導體內多種抗病毒蛋白的細胞因子合成，在抗病毒的同時還能起到調節免疫的作用[8]。本研究結果表明，3 組患者治療后 CD3＋，CD4＋，CD4＋／CD8＋的比例逐漸升高，而CD8＋的比例逐漸降低。CD3＋T淋巴細胞代表總T淋巴細胞水平，CD4＋與 CD8＋T淋巴細胞代表了主要的T細胞亞群[9]，兩者直接參與了肝細胞的損傷，在乙型肝炎慢性化的過程中起到重要作用[10]。CD4＋／CD8＋比例也反映了機體的細胞免疫功能，本研究中經過ADV、干擾素α－2b或兩者聯用治療后，該比值顯著升高，且聯用的效果顯著優于單用。T細胞是一種免疫活性細胞，其細胞核的核仁由組成區構成，早期研究已發現細胞核中存在能被硝酸銀染色的物質，不是RNA或DNA，而是一組酸性的嗜銀蛋白(AgNORs)，其作用是幫助DNA的轉錄，故其含量的高低能間接反映細胞內核酸的活性，從而反映部分細胞的整體活性變化[11]。目前，臨床常通過檢測外周血的T淋巴細胞內AgNORs的含量來判斷機體的免疫狀態。本研究結果發現，聯合組治療后外周血T淋巴細胞的AgNORs含量逐漸升高，且聯合組治療后48周的AgNORs含量顯著高于ADV組，而聯合組與干擾素組間無顯著差異。提示ADV與干擾素α－2b均能顯著提高CHB患者的細胞免疫水平，且干擾素α－2b的效果更強，兩者聯用效果最佳。

趨化因子是指一組能吸引免疫細胞移行到感染部位的小分子蛋白質，其相對分子質量多較低（8～10 kD），因其具有定向細胞趨化作用而得名，其在炎性反應中具有重要作用。外周血的炎癥細胞募集到炎癥部位的過程主要包括2個步驟，首先由選擇素與整合素介導炎癥細胞黏附在血管內皮，然后由趨化因子結合炎癥細胞表面的受體，從而介導該細胞定向遷移到炎癥部位。HBV感染能通過上調外周血清中趨化因子的表達水平來促進T細胞活化，活化后的T細胞經特異受體識別遷移至肝臟，實現減輕肝臟組織因對抗HBV而引起的炎性反應，同時清除進入人體的HBV病毒。在急性病毒性肝炎中，淋巴細胞被趨化因子募集至肝臟，從而能輔助病毒的清除。但CHB患者淋巴細胞的募集卻是致病因素之一，因為持續的慢性肝炎可導致肝纖維化、肝硬化。已有研究顯示，機體對HBV的免疫耐受與免疫應答低下是導致CHB的重要機制之一[12]，如趨化因子及其受體直接參與了淋巴細胞在肝組織內募集，并使其在其靶區域內實現增殖和活化，HBV感染細胞后，能通過調節細胞表面相關的趨化因子受體表達使淋巴細胞無法對其識別與清除[13]。本研究中檢測了所有患者治療前后外周血CXCL9，CXCL11，CCL20 3種趨化因子的表達水平，發現其均參與了HBV慢性感染患者的炎性反應[14－16]，其中CXCL9被認為是CHB患者干擾素治療效果的重要影響因素。國內已有研究表明，血CXCL9的基線水平可作為干擾素治療效果的預測指標，其表達水平較高者經過聚乙二醇干擾素治療后病毒學應答率較高，可能有利于指導慢性乙型肝炎患者的個體化用藥[17－18]。孟凡凡等[19]的研究表明，CHB患者血清CCL20水平顯著升高，是獨立于血清其他生化指標之外的病情評估指標。Xin等[20]也發現，慢性重型肝炎引起的肝功能衰竭患者的血CCL20水平顯著高于CHB患者。故認為血CCL20水平與CHB的病情嚴重程度有關。本研究中3組患者治療后外周血CXCL9，CXCL11，CCL20水平均逐漸降低，且干擾素α－2b的效果優于ADV，兩者聯用的效果最明顯，并能持續到停藥后半年，尤其是血CXCL9水平，干擾素α－2b的抑制效果最明顯。

綜上所述，與單用ADV和單用干擾素α－2b相比，ADV聯合干擾素α－2b能顯著提高CHB的臨床療效，增強細胞免疫活性，抑制外周血 CXCL9，CXCL11，CCL20的水平。