大黃素對缺氧條件下人臍靜脈內皮細胞焦亡的影響*

王 凱 施 思 雷少青 夏中元

（武漢大學人民醫院，湖北 武漢 430060）

血管內皮細胞為血管腔內的單層扁平細胞，可通過收縮和舒張調節血管內血流量，控制血管通透性，調節內環境，維持正常的生理功能［1］。內皮細胞可以通過調節血管內外液體和物質跨膜轉運而調節血液和組織液之間的物質交換［2］。在心血管疾病如高血壓、動脈粥樣硬化發生發展過程中，缺氧可以通過促進氧化應激、脂質堆積和炎癥反應增加血管內皮細胞損傷程度，促進疾病的發展［3-4］。因此減輕缺氧造成的血管內皮細胞損傷可以減輕疾病的嚴重程度。

細胞焦亡是一種炎癥反應相關的程序性細胞死亡方式，是在沙門菌感染巨噬細胞時被發現的［5］，可由細菌、病毒感染等一系列病理刺激激發，常伴有Caspase-1活化，以及大量炎性因子的產生［6］。細胞焦亡發生過程中，會在細胞膜上形成孔道，這些孔道會使細胞內滲透壓增加，細胞吸水腫脹，最終細胞膜破裂，細胞內容物釋放到細胞外［7］。

大黃素是存在于大黃和許多其他植物中的天然的蒽醌，為中藥大黃的主要有效單體，具有抗炎癥、抗氧化作用［8-9］。目前對于大黃素在缺氧條件下對細胞焦亡的影響暫未見文獻報道，本實驗擬在離體培養的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）中建立缺氧模型，觀察大黃素對缺氧條件下細胞焦亡的影響及探討其可能存在的機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材 料 HUVEC 購 自 YRGene（NC006），RPMI 1640培養基、胰酶為美國Hyclone公司產品，胎牛血清FBS為美國sciencell公司產品，大黃素和活性氧（ROS）檢測試劑盒為美國Sigma公司產品，CCK-8試劑盒為日本同仁公司產品，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白 3（NLRP3）抗體、Caspase-1抗體和 IL-1β 抗體為英國abcam公司產品，內參β-actin為美國CST公司產品，羊抗兔熒光二抗為美國Millpore公司產品。

1.2 細胞培養 HUVEC細胞在37℃、5%CO2培養箱中用含10%胎牛血清的1640培養基進行培養。待細胞密度為90%左右時，吸干皿內原培養基，用PBS洗3遍，加0.25%的胰酶將貼壁細胞消化分離，輕輕吹打均勻，使細胞徹底從培養皿底壁脫落，進行傳代培養。取處于對數期、生長狀態良好的細胞進行實驗。

1.3 分組方法 將HUVEC隨機分為4組。1）對照組：正常培養內皮細胞。2）缺氧12 h組：內皮細胞置于含有5%CO2+95%N2的三氣培養箱內經過缺氧處理12 h。3）缺氧24 h組：內皮細胞置于含有5%CO2+95%N2的三氣培養箱內經過缺氧24 h處理。4）EMO處理組：內皮細胞預先加入大黃素處理24 h后，再置于含有5%CO2+95%N2三氣培養箱內缺氧24 h。

1.4 細胞活力檢測 取HUVEC細胞懸液加入96孔板（每孔約1×104個細胞），培養24 h后加入不同濃度的大黃素溶液（0、20、40、60、80、100 μmol/L），持續培養24 h，換液后，每個孔分別加入10%的CCK-8溶液100 μL，在培養箱中孵育1 h，用酶標儀檢測450 nm出的吸光度（A），計算細胞存活率。另外取對照組、缺氧12 h組、缺氧24 h組、EMO處理組細胞懸液，檢測各組吸光度，計算細胞活力，細胞活力（%）=［A（加藥）-A（空白）］÷［A（未加藥）-A（空白）］×100%。

1.5 活性氧檢測 在6孔板中分別培養對照組、缺氧12 h組、缺氧24 h組、EMO處理組細胞 （處理方式如1.3中所述）。按照ROS檢測試劑盒說明書操作步驟，收集細胞后，加入 DCFH-DA（1 mmol/L）工作液，在37℃，5%CO2的環境中避光溫育30 min，檢測各組細胞的ROS水平。

1.6 Western blotting法檢測蛋白表達 取4組培養的細胞，去除培養基后，經PBS洗2次，加入細胞裂解液裂解細胞，收集蛋白，經BCA法測定蛋白濃度后，取20 μg上樣，經SDS-PAGE電泳、轉膜。用5%脫脂牛奶封閉 1 h。 分別用抗體 NLRP3 （1∶500）、Caspase-1 （1∶500）、IL-1β（1∶1000）以及內參 β-actin（1∶1000）進行4℃孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次10 min，加入熒光二抗（1∶10000），室溫孵育 1 h。洗膜 3 次，每次 10 min，使用Odyssey雙色紅外激光掃描顯影儀（Li-Cor公司，美國）掃描熒光蛋白條帶，用Odyssey系統軟件進行結果分析，通過目的蛋白條帶灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.7 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組細胞活性比較 見表1，表2。當大黃素濃度在0～60 μmol/L之間時，細胞活力逐漸增加，當大黃素濃度為60 μmol/L時，細胞活力明顯升高，與0 μmol/L相比差異有統計學意義（P＜0.05），當大黃素濃度高于80μmol/L時，細胞活力明顯下降，與0μmol/L和60μmol/L相比差異有統計學意義（P＜0.05），見表1，故選擇60 μmol/L預處理24 h進行后續實驗。如表2所示，缺氧12 h組細胞活力無明顯變化，與對照組相比差異無統計學意義（P>0.05），而缺氧24 h組細胞活力明顯下降，與對照組相比較差異有統計學意義（P＜0.05），經大黃素處理后，細胞活力明顯升高，與缺氧24 h組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 不同濃度大黃素作用下的細胞活力（±s）

表1 不同濃度大黃素作用下的細胞活力（±s）

與 0 μmol/L 比較，*P＜0.05；與 60 μmol/L 比較，△P＜0.05

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表2 各組細胞活力比較（±s）

表2 各組細胞活力比較（±s）

與缺氧24 h組比較，*P＜0.05；與對照組比較，△P＜0.05。下同

細胞活力0.9 3±0.0 4缺氧 1 2 h組 6 0.8 8±0.0 8缺氧 2 4 h 組 6 0.4 4±0.0 6△E M O 處理組 6 0.7 0±0.0 5*組別 n對照組 6

2.2 各組ROS水平比較 見表3。缺氧12 h組ROS水平升高不明顯，與對照組差異無統計學意義 （P>0.05），而在缺氧24 h組中，ROS水平明顯升高，與對照組差異有統計學意義 （P＜0.05）；EMO處理組ROS水平明顯下降，與缺氧24 h組差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表3 各組細胞上清ROS水平比較（±s）

表3 各組細胞上清ROS水平比較（±s）

R O S水平8 4.9 3±7.9 1缺氧 1 2 h組 6 9 4.7 3±7.3 1缺氧 2 4 h 組 6 1 2 8.3 1±1.4 2△E M O 處理組 6 1 0 1.7 1±1.9 7*組別 n對照組 6

2.3 各組焦亡蛋白表達水平比較 見圖1、表4。缺氧12 h 組 NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達水平變化不明顯，與正常對照組相比差異無統計學意義（P>0.05）， 而在缺氧 24 h 組中 NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達蛋白水平明顯升高，與正常對照組相比差異有統計學意義 （P＜0.05）；EMO 處理組 NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達水平明顯下降，與缺氧24 h組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 各組細胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對表達情況

表4 各組細胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對表達水平比較（±s）

表4 各組細胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對表達水平比較（±s）

組別 n I L-1 β N L R P 3 C a s p a s e-1對照組 6 1.0 0±0.0 0缺氧 1 2 h組 6 1.0 9±0.0 7缺氧 2 4 h 組 6 1.6 4±0.0 9△1.0 0±0.0 0 1.0 0±0.0 0 1.0 6±0.0 8 1.1 3±0.0 9 2.0 9±0.1 9△ 1.7 6±0.1 1△E M O 處理組 6 1.3 2±0.0 9*1.6 8±0.0 7* 1.4 7±0.0 5*

3 討 論

缺氧導致的血管內皮細胞結構和功能受損是促進多種心血管疾病的發生和發展的重要因素［10］。本實驗通過體外建立細胞缺氧模型，模擬在體血管內皮細胞缺血缺氧環境，有利于排除其他在體因素的干擾，可以較為準確地研究缺氧單一因素對內皮細胞的影響。在缺氧條件下，可以通過多種途徑使內皮細胞ROS產生增多［11-12］。ROS是細胞代謝過程中產生的一系列活性氧簇，ROS可通過半胱天冬氨酸蛋白酶、溶酶體蛋白酶或是內切核酸酶引起3種類型的程序性細胞死亡，分別是細胞凋亡、自噬和細胞焦亡［13］。細胞焦亡作為一種程序性的細胞死亡方式，主要通過激活NOD樣受體（NLRs），尤其是NLRP3炎性小體而發揮作用。在細胞缺氧后，細胞內產生的ROS激活NLRP3炎性小體，激活的NLRP3炎性小體一方面可以激活IL-1β，進而引起細胞焦亡加重細胞損傷。

大黃素作為蒽醌衍生物可以使胞漿中Ca2+濃度降低和 ROS 的產生［14］，減少 Caspase-1 和 IL-1β 的活化，減輕細胞焦亡，減輕細胞損傷。目前有學者認為，Caspase-1的激活是IL-1β活化以及焦亡發生的關鍵步驟，但是Caspase-1是如何激活IL-1β和焦亡，目前尚未見文獻報道。本研究結果表明，與正常氧濃度培養的細胞相比，細胞在缺氧條件下，ROS產生增加，進而激活Caspase-1前體蛋白，活化的Caspase-1剪切加工IL-1β，進而使IL-1β活化，導致細胞焦亡增加。缺氧細胞進過大黃素處理后，細胞內ROS水平下降，Caspase-1和IL-1β活化減少，細胞焦亡減少，損傷減輕。

綜上所述，本研究結果表明缺氧誘導焦亡發生，而大黃素可以通過抑制缺氧細胞ROS的產生，抑制NLRP3炎性小體和Caspase-1活化，減少焦亡發生。本研究結果提示，大黃素對缺氧血管內皮細胞有保護作用，可以減少血管內皮細胞損傷，進而發揮其對心血管疾病的防治作用。