電針對功能性消化不良大鼠MEK-ERK1/2信號通路的影響*

康朝霞 徐派的△ 唐 雷 王計雨 韓永麗 張紅星

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061；2.湖北省武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北 武漢430022）

功能性消化不良（FD）為多見的功能性胃腸疾病之一，根據(jù)羅馬Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)D被認為是具有早飽、餐后飽脹、上腹痛或上腹燒灼感等不適，但不存在可以解釋以上不適的器質(zhì)性、代謝性、全身性病變［1］。根據(jù)全球流行病學(xué)的數(shù)據(jù)，F(xiàn)D以20.8%的高患病率，占用了大量醫(yī)療資源［2］。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一類細胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因為它調(diào)節(jié)多種多樣的細胞反應(yīng)，包括調(diào)節(jié)細胞周期，影響分化、存活和凋亡［3］。并且研究發(fā)現(xiàn)AMPK在調(diào)節(jié)應(yīng)激炎癥反應(yīng)發(fā)揮中重要作用，參與了胃黏膜上皮增殖、分化與凋亡等過程的調(diào)控［4］。與細胞信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）相關(guān)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認為是經(jīng)典的絲裂原活化蛋白激酶（MEK）信號途徑，被各種刺激因素激活后，可調(diào)節(jié)胃腸黏膜上皮細胞的增殖與修復(fù)，與結(jié)腸炎、胃炎等胃腸疾病密切相關(guān)。本實驗采用夾尾刺激法構(gòu)建FD大鼠模型，采用臨床常用的電針療法進行干預(yù)，旨在觀察電針對FD模型大鼠MEK、ERK1/2蛋白及其磷酸化蛋白表達的影響，以探討其可能的作用機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD 8周齡雄性大鼠40只購于湖北實驗動物研究中心，體質(zhì)量（200±20）g，飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF動物房，動物房溫度控制在（22±2） ℃，濕度（60±10）%，明/暗每 12小時交替。每 5只單籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始實驗。

1.2 試藥與儀器 環(huán)球牌0.3 mm×25 mm一次性無菌針灸針；韓式穴位神經(jīng)刺激儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司，200A型）；兔多抗 MEK1/2抗體 （45 kD）（Affinity#AF6385；兔多抗 ERK1/2（42/44 kD）（睿瀛生物公司#RLT1625）；兔多抗磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1/2（p-MEK1/2）（Ser221，44 kD）（Affinity#AF3385）；兔多抗磷酸化細胞信號調(diào)節(jié)激酶1/2（p-ERK1/2）（Thr202/Tyr204，44/42 kD）（Affinity#AF1015）。

1.3 分組與造模 將40只雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組（10只）及造模組（30只）。對30只造模組大鼠進行造模，將其中造模成功的20只大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組（10只）及電針組（10只）。造模方法依據(jù)參考文獻采用夾尾刺激+不規(guī)則飲食的復(fù)合造模方法制備FD模型［5］。用紗布纏繞的血管鉗夾大鼠尾巴末尾1/3段（盡量不使大鼠尾巴破皮），令大鼠尖叫、暴怒，引起同籠大鼠彼此廝打，每次持續(xù)30 min，每日2次（分別在上午9點，下午4點），連續(xù)造模14 d。同時進食與禁食每24小時進行交替（即隔日給予每籠220 g飼料），正常給予每日每籠400 mL水。造模大鼠呈現(xiàn)毛發(fā)粗糙、枯黃，進食、飲水下降，活動減弱，扎堆乃至蜷縮，情志抑郁不安，表明造模成功。電針干預(yù)方法：電針組大鼠造模成功后，進行電針干預(yù)。用自制大鼠捆綁衣將電針組大鼠束縛并懸掛于懸掛裝置上。用0.3 mm×25 mm一次性不銹鋼針刺大鼠雙側(cè)“足三里”穴 0.3～0.5 寸（定位參照《大鼠穴位圖譜的研制》［6］），得氣后接韓式電針儀（疏密波，2 Hz/100 Hz，2 mA）每次30 min，每日1次，共10 d。空白組及模型組大鼠在治療階段予以穿鼠衣捆綁并懸掛在懸掛裝置上30 min，但不接受電針干預(yù)。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 胃竇取材：電針干預(yù)10 d后，將3組大鼠禁食24 h（期間不禁水）。按照大鼠體質(zhì)量（100 g為單位）予以7%水合氯醛0.5 mL進行腹腔注射麻醉，麻醉后將大鼠固定于自制鼠板上，剖腹，結(jié)扎胃賁門和幽門后剪下大鼠胃，沿胃大彎剪開胃體，洗凈胃內(nèi)容物后濾紙擦干，剪下胃竇放于凍存管中后立即置于液氮中快速凍存，存于-80℃冰箱中待測。用免疫蛋白印跡（Western blotting）法檢測胃竇組織中MEK、ERK1/2及p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料（±s）表示。首先，進行正態(tài)性、方差齊性分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性者，選用單因素方差分析（ANOVA）進行多組間比較，進一步的組間兩兩比較用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠胃組織MEK、ERK1/2蛋白水平比較見表1，圖1。與空白組比較，模型組大鼠胃組織MEK、ERK1/2蛋白表達增加（P<0.05）；與模型組比較，電針組胃組織MEK、ERK1/2表達降低（P<0.05）。結(jié)果說明電針足三里可以降低FD大鼠MEK、ERK1/2蛋白水平。

表1 各組大鼠胃竇MEK/GAPDH、ERK1/2/GAPDH灰度比值比較（±s）

表1 各組大鼠胃竇MEK/GAPDH、ERK1/2/GAPDH灰度比值比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。 下同

組別 n M E K/G A P D H E R K 1/2/G A P D H空白組 1 0 0.2 0 2±0.1 1 3 0.2 6 2±0.1 9 5模型組 1 0 0.5 6 4±0.0 9 9* 0.7 9 6±0.1 0 7*電針組 1 0 0.2 5 8±0.3 8△ 0.4 7 2±0.1 2 1△

圖1 各組大鼠胃竇MEK、ERK蛋白免疫印跡圖

2.2 各組大鼠胃組織p-MEK、p-ERK1/2蛋白水平比較 見表2，圖2。與空白組比較，模型組大鼠胃組織p-MEK、pERK1/2 蛋白表達水平升高（P<0.05）；與模型組比較，電針組胃組織p-MEK、p-ERK1/2表達水平降低（P<0.05）。結(jié)果說明電針足三里可以降低FD大鼠p-MEK、p-ERK1/2蛋白水平的表達。

表2 各組大鼠胃竇p-MEK/GAPDH、p-ERK1/2/GAPDH灰度比值比較（±s）

表2 各組大鼠胃竇p-MEK/GAPDH、p-ERK1/2/GAPDH灰度比值比較（±s）

組別 n p-M E K/G A P D H p-E R K 1/2/G A P D H空白組 1 0 0.1 3 0±0.0 4 3 0.2 1 5±0.0 9 8模型組 1 0 0.5 1 5±0.0 7 9* 0.8 2 2±0.0 8 1*電針組 1 0 0.2 4 5±0.3 8 9△ 0.4 5 9±0.1 0 9△

圖2 各組大鼠胃組織p-MEK、pERK1/2蛋白免疫印記圖

3 討 論

功能性胃腸道疾病，如FD、腸易激綜合征（IBS），具有相當(dāng)大的社會經(jīng)濟負面影響［7］。雖然FD不會危及生命，但它會顯著影響患者的生活質(zhì)量（QOL）［8］并導(dǎo)致高昂的醫(yī)療費用［9］。如今，眾多藥物如質(zhì)子泵抑制劑（PPI）、三環(huán)類抗抑郁藥，抗傷害性藥物和促運動劑已被用于治療FD［10］，但由于其臨床表現(xiàn)多樣性、差異大的特點，療效不甚滿意。因此，越來越多的患者開始尋求一種經(jīng)濟、療效好的替代療法。近年來，針刺、電針等經(jīng)大量的臨床、實驗研究證明，治療FD療效顯著［11］，且具有經(jīng)濟、無明顯的毒副作用的優(yōu)勢。本課題組在以往研究中也證實了電針足三里穴對FD具有良好的治療作用。

FD在中醫(yī)學(xué)隸屬于“胃脘痛”“痞滿”等范疇，其病因病機為飲食不節(jié)、情志不遂等，病變在胃，與肝脾密切相關(guān)。本實驗從本病的病因出發(fā)，采用適度夾尾刺激配合隔日進食的造模方法，模擬人體肝郁氣滯、脾胃失和的發(fā)病機理，使造模成功的概率大大提升。在臨床運用針刺治療FD療效甚好，并且其治療作用在臨床及動物實驗中均得到了證實。而足三里為足陽明胃經(jīng)合穴，又是胃的下合穴，“合治內(nèi)腑”，善調(diào)脾胃，調(diào)腸腑，滋后天生化之源。《四總穴歌》“肚腹三里留”充分說明了足三里穴善治脾胃的特點。目前，“足三里”已經(jīng)成為電針治療FD的公認效穴。電針的運用，不但傳承了傳統(tǒng)針灸的特色，并且還融會了電刺激的生理效應(yīng)，卓有成效。

MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過參與細胞生長、發(fā)育、分化和死亡過程，以及細胞間各種生化反應(yīng)的識別、傳遞和擴增，在誘導(dǎo)細胞凋亡和調(diào)節(jié)應(yīng)激炎癥反應(yīng)中起著重要作用［12-13］，參與了胃黏膜上皮增殖、分化與凋亡的調(diào)控。MAPK經(jīng)典信號途徑——與ERK1/2相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可被各種信號刺激（如炎癥、神經(jīng)損傷、神經(jīng)遞質(zhì)）而激活，而活化的ERK1/2，即p-ERK1/2可通過激活或抑制其他蛋白激酶底物，從而調(diào)節(jié)蛋白合成，影響細胞代謝，從而參與細胞存活、增殖、分化與遷移等過程［14-15］。已有研究表明，ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與胃腸黏膜細胞的增殖與修復(fù)過程［16-18］，對于胃腸黏膜的防御與修復(fù)具有重要影響，與胃炎、胃潰瘍等疾病密切相關(guān)。本實驗采用免疫印跡法檢測FD大鼠胃竇組織中MEK、ERK1/2蛋白表達及磷酸化程度，結(jié)果表明，與空白組相比模型組大鼠MEK、ERK1/2蛋白表達及其磷酸化程度均升高，說明在FD模型大鼠胃竇組織中，呈現(xiàn)MEK、ERK1/2及其磷酸化蛋白p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達的異常升高，而電針足三里穴抑制了FD模型大鼠胃竇MEK、ERK1/2蛋白表達及其磷酸化程度。因此MEK-ERK1/2信號通路參與電針干預(yù)FD的過程，電針可能通過抑制MEK/ERK1/2信號的激活改善FD相關(guān)癥狀，為電針治療FD的機制研究提供新的研究線索，而有關(guān)MEK-ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在電針治療FD大鼠過程中的具體作用機制，還有待我們進一步研究。