中風1號對急性腦出血大鼠神經功能和腦組織形態的影響*

孫德陽 朱永志 楊 洋 梁 群△

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱 150040）

腦出血具體是指非外傷性腦實質內血管破裂引起的出血［1］，病情急重，早期死亡率高，幸存者中多數留有不同程度的認知、運動和言語吞咽障礙等后遺癥［2-3］。腦出血后在腦實質內形成血腫，血腫壓迫進而對大腦神經功能造成損傷。西醫治療主要體現在脫水降顱壓、調整血壓、防止繼續出血、加強護理維持生命功能等對癥治療上，效果不甚理想［4］。近年來中醫辨證論治原則在腦出血治療上的應用，又為其治療提供了新的突破口［5］。前期實驗研究發現中風1號能夠明顯降低急性腦出血大鼠血清NSE水平［6］。本研究旨在前期研究的基礎上利用透射電子顯微鏡在亞顯微結構上觀察中風1號對急性腦出血大鼠出血灶周圍神經細胞凋亡的影響，同時通過神經功能評分及腦組織含水量評估中風1號對大鼠神經功能的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠，雄性，體質量（250±20）g由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，按SPF級別標準飼養，許可證號：SCXK（京）2016-0006。

1.2 試藥與儀器 中風1號湯劑主要由水蛭10 g，生大黃5 g，澤瀉10 g，三七粉10 g，生地黃5 g配伍而成（由黑龍江中醫藥大學附屬一院制劑室通過水提醇沉法提取藥物有效物質）；20%甘露醇 （石家莊四藥有限公司，規格：250 mL/瓶，國藥準字 H1302303）；注射用青霉素鈉 （石藥集團中藥藥業有限公司，規格：2.4 g/瓶，批號：024170286）。透射電子顯微鏡（H-7650型，HITACHI公司）；超薄切片機（EMUC7 型，Leica公司）；無水乙醇 （A500737，生工生物工程股份有限公司）；50%戊二醛（A500484，生工生物工程股份有限公司）；丙酮（179973，Sigma）；鋨酸（RBS0085，榕柏生物）；包埋液（上海杰美基因醫藥科技有限公司）。

1.3 分組與造模 將50只雄性SD大鼠按隨機數字表法分為5組，即中風1號組、甘露醇組、模型組、假手術組、空白組。假手術組為對照組，每組10只。分別觀察各組動物用藥前后神經功能評分、腦組織水含量、腦出血灶周圍神經細胞情況。制備大鼠急性腦出血模型，用水合氯醛按0.4 μL/1 g腹腔注射的方式進行麻醉大鼠。大鼠麻醉后將大鼠按照俯臥位的姿勢固定在立體定位儀上，儀器雙側耳棒固定大鼠耳部，同時將大鼠的口齒固定于立體定位儀的口齒溝上 （耳尖平面相對于口齒溝平面高約2 mm）［7］。固定好大鼠之后用手術刀暴露大鼠前囟點，在前囟點右3.5 mm，后0.2 mm用牙科鉆直徑約1.0 mm圓孔，切勿過深傷及硬腦膜。鼠尾醫用酒精消毒后，用5 mL注射器抽取尾部動脈血約70 μL，然后用微量注射器抽取60 μL。后通過定位圓孔將血液緩慢注入大鼠腦內（20 μL/min），留針靜置觀察10 min。留針觀察的同時包扎鼠尾取血處的傷口。無異樣后拔針并用牙科用水泥封閉創口，同時在操作區域涂抹青霉素鈉，縫合手術傷口，以防止感染影響指標變化［8］。假手術組：造模方法與上述相同，但是不向大鼠腦內注射血液。給藥按成人劑量與人體質量換算系數的比例公式計算大鼠給藥劑量。中風1號組：中風1號湯劑1.5 mL灌胃，每日2次；0.9%氯化鈉注射液1 g/kg，每日2次尾靜脈注射，術后持續給藥5 d。甘露醇組：0.9%氯化鈉注射液1.5 mL灌胃，每日2次；甘露醇1 g/kg，每日2次尾靜脈注射，術后持續給藥5 d。模型組：0.9%氯化鈉注射液1.5 mL灌胃，每日2次；0.9%氯化鈉注射液1 g/kg，每日2次尾靜脈注射。假手術組：0.9%氯化鈉注射液1.5 mL灌胃，每日2次；0.9%氯化鈉注射液1 g/kg，每日2次尾靜脈注射，術后持續給藥5 d?？瞻捉M：0.9%氯化鈉注射液1.5 mL灌胃，每日2次；0.9%氯化鈉注射液1 g/kg，每日2次尾靜脈注射，術后持續給藥5 d。

1.4 標本采集與檢測 1）神經功能評分：采用雙盲法，各個時間點利用longa對各組大鼠進行神經功能評分，無神經功能障礙獲得0分；對側前肢彎曲，不能完全伸展獲得1分；大鼠爬行時向對側劃圈，不能直線行走獲得2分；大鼠爬行時向對側傾倒獲得3分；意識水平降低，不能自發爬行獲得4分。所得分數越高其運動障礙越明顯。2）腦組織含水量測定：采用干濕重法，取大鼠進行過量麻醉，直接斷頭后取腦，去除嗅球部分，立即使用分析天平稱濕重，然后于90℃干燥24 h，再稱腦組織干重。計算腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。3）腦組織病理切片制作：取大鼠腦部出血部位1 mm3處。立刻進行固定：2.5%戊二醛固定；用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min，漂洗3次；1%鋨酸固定液固定2～3 h；用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min，漂洗 3次［9-10］。然后進行乙醇梯度脫水（在 4℃冰箱內進行）：50%乙醇，15～20 min；70%乙醇，15～20 min；90%乙醇，15～20 min；90%乙醇與 90%丙酮（1∶1），15～20 min；90% 丙 酮 ，15～20 min。 后 于 室 溫 下100%丙酮，15～20 min，進行 3 次［11］。 包埋：純丙酮與包埋液（2∶1）混合液，室溫進行 3～4 h處理；純丙酮與包埋液（1∶2）混合液，室溫過夜；純包埋液37℃，處理2～3 h。固化：37℃烘箱內過夜；45℃烘箱內處理12 h；60℃烘箱內處理24 h。超薄切片機切片50～60 nm后用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，置于透射電鏡下觀察，拍片［12-13］。

1.5 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間數據比較用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠術后0 d、5 d神經功能評分比較 見表1。模型組、中風1號組、甘露醇組大鼠術后0 d神經功能評分與空白組和假手術組差異有統計學意義 （P＜0.01），其中模型組、中風1號組、甘露醇組各組間數據差異無統計學意義（P>0.05），證明造模成功。模型組、中風1號組、甘露醇組大鼠術后5 d神經功能評分與空白組和假手術組差異有統計學意義（P＜0.01），中風1號組、甘露醇組與模型組差異有統計學意義（P＜0.01），中風1號組和甘露醇組差異無統計學意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠術后0 d、5 d神經功能評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠術后0 d、5 d神經功能評分比較（分，±s）

與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組 別 n 0 d 5 d空白組 1 0 0.0 0±0.0 0 0.0 0±0.0 0假手術組 1 0 0.0 0±0.0 0 0.0 0±0.0 0模型組 9 2.4 2±0.7 5 0** 3.2 5±0.5 2 8**中風 1 號組 9 2.4 0±0.9 8 8** 2.1 1±0.9 9 8**△△甘露醇組 9 2.3 9±0.8 6 5** 2.0 7±0.9 7 7**△△

2.2 各組大鼠術后腦組織含水量比較 見表2。模型組、中風1號組、甘露醇組大鼠術后5 d腦組織含水量與空白組和假手術組差異有統計學意義（P＜0.01），中風1號組、甘露醇組與模型組差異有統計學意義（P＜0.01），中風1號組和甘露醇組差異無統計學意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠術后5 d腦組織含水量比較（±s）

表2 各組大鼠術后5 d腦組織含水量比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組 別 n 腦含水量空白組 1 0 7 7.2 5±0.3 8假手術組 1 0 7 7.2 8±.0.3 5模型組 9 8 3.3 8±0.6 2*中風 1 號組 9 7 9.8 2±0.8 5*△甘露醇組 9 7 9.2 0±0.7 6*△

2.3 各組大鼠腦組織病理切片 見圖1?？瞻捉M大鼠出血灶周圍神經元核膜完整，雙層膜結構清楚，線粒體形態正常，基質密度適中，細胞內細胞器數量豐富，線粒體數量也較豐富；模型組大鼠出血灶周圍神經元細胞膜破裂、不清楚，核固縮較明顯，細胞器數量減少，線粒體腫脹、損傷較嚴重；假手術組大鼠出血灶周圍神經元核膜完整，雙層膜結構清楚，線粒體形態正常，基質密度適中，細胞內細胞器數量豐富，線粒體數量也較豐富；中風1號組大鼠出血灶周圍神經元核膜完整、較清楚，少量線粒體腫脹，細胞內細胞器數量較少；甘露醇組大鼠腦出血灶周圍神經元核膜雙層結構完整，核有輕微固縮現象，少量線粒體發生腫脹，細胞內細胞器數量較少。

圖1 各組大鼠腦組織病理切片（HV:80 kV，1000倍）

3 討 論

腦出血后血液積聚于大腦表面，壓迫腦組織，引發腦水腫，致使顱內壓增大增高，且刺激腦膜引起無菌性腦膜炎反應。血液阻塞腦脊液循環通路還可發生梗阻性腦積水，外溢血液中還有多種活性物質，如5-羥色胺、兒茶酚胺、血紅蛋白分解物等刺激血管和腦膜，誘發腦血管痙攣，使腦組織缺血出現意識障礙或腦梗死［14-16］。而目前西醫的治療主要集中在控制繼續出血、降低顱內壓、防止復發、去除病因和防止并發癥等對癥治療方面，但腦出血起病急，病情發展迅速，發生機制復雜，以上治療效果不甚理想，且預后效果不佳。中醫學認為本病多因積損正衰，勞倦內傷，肝陽暴亢，情志不暢，肝氣不舒，不得疏泄，肝郁化火，心火爆亢導致，最常見的誘因是氣候驟變，勞煩過度，情志過激，飲酒飽食等?？傮w病機因上述因素致腦絡之血破入腦室，新成“瘀血”阻絡，現代醫學手段也有與其相對應的診斷證明，如腦出血后凝血功能試驗結果的改變，血液常規中血小板的改變，都證明急性腦出血后腦內血液流動性變慢［17-18］，故提出腦出血急性期非手術中醫治療的方法應該以祛瘀行水為主。

中風1號由水蛭 10 g，生大黃5 g，澤瀉 10 g，三七粉10 g，生地黃5 g配伍而成，是朱永志教授在多年臨床工作中總結的治療急性腦出血有效的經驗方，具有祛瘀通絡之功效。水蛭主逐惡血、瘀血，現代藥理研究表明水蛭的主要成分有氨基酸、肽類、抗血栓素、肝素等，具有抗凝、抑制血栓形成、抗血小板聚集、腦保護等作用［19］；生大黃逐瘀通經，現代藥理研究表明大黃有明顯的促進血凝作用，對微循環具有雙向調節作用，能降低毛細血管通透性，能使血小板、纖維蛋白質增加，縮短出血和血凝時間［20］；澤瀉利水滲濕，現代藥理研究表明其含有澤瀉醇A乙酸酯或澤瀉醇B，能有效增加尿素和氯化物的排除，對降低顱內壓起到一定作用［21］；三七粉化瘀止血，現代藥理研究表明三七含有三七氨酸，能夠有效縮短出血和凝血時間，具有抗血小板聚集及溶栓的作用，且有研究表明三七皂苷能夠在氧糖剝奪模型中促進大鼠海馬神經干細胞（NSCs）的增殖與分化，起到腦保護的作用［22］；生地黃清熱涼血，養陰生津，現代藥理研究表明地黃乙醇提取物所得的黃色針狀結晶能縮短凝血時間［23］?？v觀全方，諸藥綜合配伍，共奏活血祛瘀之功。

本研究是在建立急性腦出血大鼠模型的基礎上，灌胃給予中風1號，并通過評估神經功能評分、計算腦組織含水量及透射電子顯微鏡下的觀察，通過實驗觀察發現中風1號組術后5 d神經功能評分及腦組織含水量與模型組差異有統計學意義，說明中風1號能夠降低神經功能評分，并降低大鼠腦組織含水量，起到腦組織保護的作用。單純的中風1號組和甘露醇組差異無統計學意義，在西醫上脫水降低顱內壓的常用藥物是甘露醇，但是甘露醇對腎臟的損傷越來越引起人們重視，且不宜長時間使用。電鏡下發現中風1號組大鼠組織神經元超微結構明顯好轉，核膜完整程度、細胞器數量也較模型組明顯增多。線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，被稱作能量工廠，而且它除了為細胞提供能量以外，還參與細胞分化、信息傳遞和細胞凋亡等諸多環節，有研究表明線粒體在細胞凋亡環節處于中心地位［24-25］。本實驗觀察發現中風1號組線粒體形態、腫脹程度、基質密度、數量較模型組明顯改善。推測其原因可能是中風1號能促進線粒體結構的恢復，為腦出血造成神經元損傷的修復提供能量，從而保護起到腦組織神經，促進預后的作用。