玉香參附湯對心臟驟停大鼠的心肌保護作用及對Nrf2、NQO1、HO-1表達的影響*

李 涵 姬廣輝 郭立杰 呂菲菲 關 杉

（中國人民解放軍海軍總醫院，北京 100048）

心臟驟停是指由于循環衰竭導致心率驟停，是導致心臟性猝死的主要危險因素。心臟驟停時，心臟由于喪失泵血功能導致機體處于缺血狀態，引起腦、心肌等組織器官因缺血缺氧發生病理性損傷［1］。及時有效地進行心肺復蘇可一定程度逆轉該過程，然而臨床研究表明，復蘇成功率較低，患者遠期預后效果差［2］。研究證實，氧化應激損傷、活性氧過度產生等可能參與缺血/再灌注所致心肌損傷的發生過程，心臟缺血缺氧可進一步抑制心肌功能，導致活性氧、脂質過氧化物等過度累積，加重損傷［3-4］。傳統中藥方劑玉香參附湯對心力衰竭患者有明顯的改善作用，包含其主要成分紅參和附片的參附益心顆粒可有效保護急性心梗大鼠心肌損傷，阻滯慢性心衰的發生［5］，但玉香參附湯對心臟驟停/心肺復蘇后大鼠心肌功能的作用尚不清楚。本研究通過構建心臟驟停/心肺復蘇大鼠模型，觀察玉香參附湯對心臟驟停/心肺復蘇大鼠心肌損傷的影響并初步探討其機制，旨在探究其保護心臟驟停/心肺復蘇大鼠心肌損傷的分子機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠90只，體質量（180～200）g，SPF級別，購自廣東省醫學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）-2015-0002。所有研究用大鼠集中常規飼養于本院實驗動物中心，給予所有大鼠自由飲水、飲食，進行適應性飼養1周。所有實驗均遵循《實驗動物管理條例》。

1.2 試藥與儀器 玉香參附湯（玉竹20 g，香加皮5 g，預煎紅參10 g，預煎制附子10 g，女貞子10 g，丹參15 g，桑寄生10 g，白前10 g），藥材購于北京同仁堂藥店，每劑加入500 mL煎煮至150 mL，再次加水煎煮至150 mL，將兩次煎劑合并，熬制成膏狀（生藥含量2 g/mL），置于4℃冷藏備用。使用時采用0.9%氯化鈉注射液稀釋，灌胃給藥劑量按體表面積進行換算得出。依拉達奉注射液（規格：20 mL，30 mg。 批號 20150133），購自昆明積大制藥公司；蘇木素-伊紅HE染色試劑盒（貨號 E607318）、蛋白定量試劑盒（貨號 C600641），購自上海生工生物技術公司；丙二醛（MDA）試劑盒（貨號 S0131）、谷胱甘肽（GSH）試劑盒（貨號 S0073）、活性氧（ROS）試劑盒（貨號 S0033）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（貨號 S0082）、超氧化歧化酶（SOD）試劑盒（貨號S0087），購自碧云天公司；DAB顯色試劑盒，購自中杉金橋公司；兔源一抗Anti-Nrf、Anti-NQO1、Anti-HO-1、Anti-GAPDH、Anti-Histone H3，羊抗兔二抗，購自美國CST公司；石蠟切片機，德國Leica公司；普通光學顯微鏡、熒光顯微鏡，購自日本Olympus公司；蛋白電泳儀、半干轉膜儀，美國Bio-Rad公司等。

1.3 分組與造模 按照隨機數字表法將90只大鼠隨機分為對照組、模型組，玉香參附湯低、中、高劑量組，依拉達奉組，每組15只。對除對照組外大鼠，按照文獻［6］采用交流電經食管刺激誘導心室顫動法復制心臟驟停模型，心臟驟停5 min后，開始心肺復蘇，1 min時給予各大鼠靜脈注射腎上腺素（0.02 mg/kg），若無效則于4 min時重復心肺復蘇，5 min內未成功復蘇大鼠為造模失敗，從備用大鼠中根據隨機原則補足各組例數。對照大鼠僅給予氣管插管，不誘導心臟驟停。術后正常給予常規飼養，記錄各組大鼠生存情況，持續觀察72 h。玉香參附湯低、中、高劑量組大鼠于術后當日起，每日分別予玉香參附湯［5 mg/（kg·d）］、［10 mg/（kg·d）］、［20 mg/（kg·d）］灌胃治療，灌胃容積為 10 mL/500 g；依拉達奉組大鼠于術后當天起，每日給予依拉達奉［5 mg/（kg·d）］灌胃治療，灌胃容積為 10 mL/500 g；對照組及模型組于術后當天起，每日給予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃，持續72 h后，給予各大鼠處分麻醉處死，立即取出大鼠心臟，洗凈后對稱切半，一半切成1 cm大小3小塊后分成2份，一份用于ROS水平檢測，一份置于4%多聚甲醛中固定，制備石蠟切片；一半切碎后分為2份，一份制備組織勻漿液，一份采用液氮速凍，轉至-80℃保存。

1.4 標本采集與檢測 1）HE法觀察心肌組織結構：大鼠心肌組織切片進行脫蠟、水化操作。采用蘇木素-伊紅（HE）試劑盒對切片染色，完成后以中性膠封閉玻片，采用光學顯微鏡觀察并拍照。2）心肌組織ROS水平測定：采用ROS試劑盒檢測大鼠心肌組織中ROS水平，以DCFH-DA標記活性氧，陽性細胞呈紅色熒光，以DAPI試劑標記細胞核，陽性細胞呈藍色熒光，以紅色熒光細胞占藍色熒光細胞的比例評估心肌細胞中ROS水平。3）心肌組織MDA含量、CAT活性及SOD活性、GSH含量的測定：將大鼠心肌組織勻漿液取出，嚴格按照MDA檢測試劑盒、GSH檢測試劑盒、CAT檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒操作說明書檢測各組大鼠心肌組織中MDA含量、GSH含量及CAT活性、SOD活性。 4）蛋白印記（WB）法檢測 Nrf2、NQO1、HO-1 蛋白表達：將大鼠心肌冷凍組織充分研磨，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，采用細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒提取各組大鼠心肌組織中細胞質及細胞核總蛋白，采用蛋白定量試劑盒測定蛋白總量后，煮樣，進行SDS-凝膠電泳。電泳后采用半干法轉印至PVDF膜上；5%脫脂奶粉常溫封閉1 h；分別加入兔源一抗Anti-Nrf、Anti-NQO1、Anti-HO-1、Anti-GAPDH、Anti-Histone H3（1∶500），4℃孵育 6h；加入羊抗兔二抗（1∶3 000），室溫孵育30 min。采用化學發光試劑盒處理后進行檢測，Tanon軟件拍攝目的條帶圖像并進行分析。

1.5 統計學處理 應用SPSS25.0統計軟件。計量數據均以（±s）表示，多重比較行單因素方差分析，兩兩比較行t檢驗；計數資料采用“率”表示，行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠生存情況比較 見表1。與對照組比較，模型組大鼠總存活時間顯著縮短、30 d存活率明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，玉香參附湯低、中、高劑量組及依拉達奉組大鼠總存活時間顯著延長（P＜0.05）、30 d存活率明顯升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠生存情況比較

2.2 各組大鼠心肌組織結構比較 見圖1。對照組大鼠心肌組織結構規則、心肌細胞緊致排列、心肌纖維完整、排列規則。心臟驟停大鼠心肌細胞排列紊亂，心肌纖維斷裂、排列紊亂，出現大量破碎、壞死和炎性細胞，呈現出病理損傷。玉香參附湯低、中、高劑量組及依拉達奉組大鼠心肌組織中病變細胞減少，心肌纖維趨于完整，損傷情況均有改善。

圖1 HE染色觀察玉香參附湯對心肌組織結構的影響（HE 染色，20倍）

2.3 各組大鼠心肌組織ROS水平的比較 見圖2。與對照組比較，心臟驟停大鼠心肌組織中ROS陽性細胞比例顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量玉香參附湯組大鼠心肌組織中ROS陽性細胞比例顯著減少（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠心肌組織中ROS表達（DHE熒光，200倍）

2.4 各組大鼠心肌組織氧化應激水平的比較 見表2。與對照組比較，其他各組心臟驟停大鼠心肌組織中MDA含量升高、GSH含量降低、CAT和SOD酶活減弱（P＜0.05）；與模型組比較，玉香參附湯低、中、高劑量組及依拉達奉組大鼠心肌組織MDA含量降低、GSH含量上升、CAT和SOD酶活增強（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠心肌組織中Nrf2、NQO1、HO-1表達的比較 見圖3，表3。與對照組比較，心臟驟停大鼠心肌組織NQO1、HO-1蛋白表達量明顯降低，細胞質Nrf-2蛋白表達量顯著增高，細胞核Nrf-2蛋白表達量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，玉香參附湯低、中、高劑量組及依拉達奉組大鼠心肌組織NQO1、HO-1蛋白表達量明顯增高（P＜0.05），細胞質Nrf-2蛋白表達量明顯降低（P＜0.05），細胞核Nrf-2蛋白表達量明顯增高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠心肌組織中MDA含量、GSH含量、CAT活性及SOD 活性比較（±s）

表2 各組大鼠心肌組織中MDA含量、GSH含量、CAT活性及SOD 活性比較（±s）

組 別 n對照組 1 5模型組 1 5依拉達奉組 1 5 M D A（m m o l/g） G S H（m m o l/g） C A T（U/m g） S O D（U/m g）2.6 5±0.4 4 1 5.4 6±3.0 5 2 6 9.1 7±2 1.1 5 1 6 9.4 3±2 4.3 5 6.9 7±1.2 9* 5.6 3±1.1 7* 1 7 8.7 5±1 8.3 2* 7 9.5 4±1 4.7 3*3.5 4±0.6 9*△ 1 1.4 9±2.1 2*△ 2 3 1.3 8±2 3.4 7*△ 1 2 3.3 6±2 2.3 8*△玉香參附湯低劑量組 1 5 5.2 7±1.0 3*△ 7.2 4±1.3 5*△ 1 8 9.2 3±2 2.5 6*△ 1 5 7.7 4±2 3.5 9*△玉香參附湯中劑量組 1 5 4.0 4±0.8 1*△※ 9.9 5±1.8 9*△※ 2 1 6.7 6±2 1.4 5*△※ 1 4 0.9 2±2 3.1 1*△※玉香參附湯高劑量組 1 5 3.1 2±0.6 2*△※◇ 1 2.4 8±2.5 3*△※◇ 2 4 5.2 7±2 3.3 5*△※◇ 1 2 1.4 5±2 3.3 2*△※◇

圖3 各組大鼠心肌組織Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達

表3 各組大鼠心肌組織中Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達量比較（±s）

表3 各組大鼠心肌組織中Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達量比較（±s）

組 別 n對照組 1 5模型組 1 5依拉達奉組 1 5 N Q O 1/G A P D H H O-1/G A P D H質N r f/G A P D H 核N r f/H 3 1.0 8±0.1 9 1.1 7±0.0 9 0.5 1±0.1 1 1.5 4±0.2 5 0.4 9±0.0 9* 0.1 9±0.0 3* 1.4 7±0.3 1* 0.6 7±0.1 2*1.1 1±0.2 1*△ 1.2 3±0.1 3*△ 0.3 9±0.0 6*△ 1.2 3±0.2 4*△玉香參附湯低劑量組 1 5 0.6 5±0.1 1*△ 0.7 6±0.1 3*△ 0.6 9±0.1 3*△ 1.0 4±0.1 3*△玉香參附湯中劑量組 1 5 0.8 7±0.1 4*△※ 1.2 7±0.1 9*△※ 0.4 8±0.0 7*△※ 1.2 1±0.1 4*△※玉香參附湯高劑量組 1 5 1.1 6±0.2 2*△※◇ 1.3 5±0.2 1*△※◇ 0.2 0±0.0 5*△※◇ 1.6 1±0.3 6*△※◇

3 討 論

心臟驟停是臨床上一種非常危險的急癥，具有高致死率、高致殘率的特點。心肺復蘇是臨床上針對心臟驟停的主要搶救措施。隨著醫療條件的提高和醫療技術的進步，心肺復蘇技術有了很快進步，但復蘇成功率仍然很低，且后期易出現不同程度器官障礙等并發癥。其中心臟驟停時導致組織器官處于缺血缺氧狀態的時間長短和心肺復蘇恢復機體自主循環時對組織器官造成的缺血/再灌注損傷程度密切相關［7］。心臟是人體的供血器官，心肌組織作為其重要組成部分，對缺血和缺血再灌注損傷十分敏感。本研究采用交流電經食管刺激誘導心室顫動法復制心臟驟停模型［6］。結果顯示，模型組大鼠心肌細胞、心肌纖維排列紊亂，心肌纖維斷裂，出現大量破碎、壞死和炎性細胞，呈現出病理損傷，表明心臟驟停模型大鼠心肺復蘇后心肌表現出一定損傷癥狀。進一步觀察發現，模型組大鼠平均生存時間和30 d生存率均顯著低于對照組，提示心臟驟停/心肺復蘇大鼠復蘇存活率較低。

中藥玉竹、香加皮、紅參、制附子、丹參、白前等是玉香參附湯的主要藥效成分，具有活血通經、散瘀通脈的功效［8］。玉香參附湯是在參附注射液的基礎上加以中藥玉竹、香加皮等配制而成。研究表明，參附注射液可有效改善心力衰竭患者心臟功能，增強常規西藥的治療效果［9］。顧偉等研究提示，參附注射液可通過調控調節性T細胞轉錄因子表達的平衡改善心臟驟停/心肺復蘇豬的心室收縮功能，減輕氧化應激反應，縮短心肺復蘇時長，減輕心肌組織損傷，提示參附注射液具有一定的心肌保護作用［10］。本研究采用玉香參附湯作用心臟驟停/心肺復蘇大鼠，結果發現，玉香參附湯治療可顯著改善大鼠心肌組織損傷程度，提示玉香參附湯具有改善心臟驟停大鼠心肌損傷的作用，但其作用機制尚不明確。

心肌組織中氧自由基等活性氧水平的升高是缺血/再灌注引起心肌損傷的主要原因之一，在心臟驟停損傷過程中發揮著重要作用［11］。正常情況下，機體內環境中有少量ROS存在，參與正常生理代謝過程［12］。然而，當心臟驟停發生時，心臟失去基本泵血功能，機體處于缺血缺氧的環境，機體可產生并積累大量氧自由基，同時，心肌損傷狀態下，心肌組織清除氧自由基的能力減弱，進一步導致氧自由基等累積，過量活性氧可能與脂質、蛋白質等發生反應，產生MDA等脂質過氧化物，誘導細胞凋亡、死亡，進而導致組織器官功能障礙［13］。Abraham等發現，抑制心肌細胞特異性肌鈣蛋白-相互作用激酶可以通過抑制氧化應激抑制缺血性心臟病引起的心肌損傷和心室不良重構［14］。Wang等發現，黃芩可通過抑制氧化應激反應抑制心肌細胞缺血/再灌注所致細胞凋亡，保護機體損傷［15］。本研究發現，與對照組比較，心臟驟停大鼠心肌組織ROS陽性細胞比例增加、MDA含量升高、GSH含量降低、CAT和SOD酶活減弱；玉香參附湯治療后，與模型組比較，低、中、高劑量玉香參附湯組大鼠心肌組織中ROS陽性細胞比例減少、MDA含量降低、GSH含量升高、CAT和SOD酶活增強，表明玉香參附湯治療可增強心臟驟停大鼠對活性氧的清除能力，降低機體中ROS和脂質過氧化物含量，提示玉香參附湯可能通過減輕氧化損傷程度保護心臟驟停/心肺復蘇所致大鼠心肌損傷。

研究表明，氧化應激導致的細胞損傷與核轉錄因子（Nrf2）/血紅素氧合酶 1（HO-1）信號通路密切相關［16］。研究發現，正常狀態下，細胞質中Nrf2蛋白以與Keap1蛋白結合的無活性形式存在，受到活性氧等刺激時，Nrf2發生磷酸化后與Keap1脫離，轉移至細胞核，活化后的Nrf2與抗氧化反應元件結合，啟動NADH脫氫酶1（NQO1）、HO-1等抗氧化酶的基因表達，提高機體抗氧化損傷的能力［17-18］。Liu等發現，蘿卜硫素可通過抑制Nrf2等蛋白表達，抑制活性氧所致晶狀體上皮細胞凋亡和壞死［19］。Zhang等發現，黃連素可能通過抑制Nrf2通路激活，減輕活性氧誘導的腎小管上皮細胞凋亡，保護腎組織損傷［20］。本研究發現，心臟驟停/心肺復蘇后，大鼠心肌組織NQO1、HO-1蛋白表達量降低，Nrf-2蛋白細胞核轉移量減少；玉香參附湯治療后，與模型組比較，低、中、高劑量玉香參附湯組大鼠心肌組織NQO1、HO-1蛋白表達量升高，Nrf-2蛋白細胞核轉移量增多，表明玉香參附湯可能通過促進Nrf-2蛋白細胞核轉移進而促進其下游NQO1、HO-1等蛋白表達保護心臟驟停/心肺復蘇所致大鼠心肌損傷。

綜上所述，玉香參附湯可能通過促進Nrf-2、NQO1、HO-1蛋白表達，減輕心肌組織氧化應激，實現對心臟驟停/心肺復蘇所致心肌損傷的保護作用。