白黎蘆醇對宮頸癌Hela細胞中人程序化死亡分子5蛋白、mRNA表達的影響

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(鄭州大學第一附屬醫院病理科、河南省腫瘤病理重點實驗室，河南 鄭州 450052)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發生、發展是多基因、多因素共同參與的過程，隨著對腫瘤發病機制的研究不斷深入，發現惡性腫瘤的發生、發展及預后與細胞凋亡相關基因的改變密切相關。人程序化死亡分子5(human programmed cell death 5，PDCD5)基因在細胞的凋亡過程中起著關鍵性作用，在體外能抑制多種腫瘤細胞的生長，明顯促進其凋亡[1]。白黎蘆醇是從葡萄、花生、虎杖等藥用植物中提取的有效成分，在體外能上調多種腫瘤細胞株中PDCD5的表達[2-4]，本實驗旨在探討PDCD5在宮頸癌Hela細胞中的表達及其與細胞凋亡的相關性，為宮頸癌的臨床治療提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1材料人宮頸癌Hela細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院；白黎蘆醇購自西安天行健生物公司；5’端生物素標記PDCD5 cDNA探針 (5’CGG CCA GCC TCT GTC TCC TCA 3’)購自北京奧科生物技術公司；PDCD5免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1 免疫細胞化學 采用免疫細胞化學檢測宮頸癌Hela細胞中PDCD5蛋白表達，將宮頸癌Hela細胞進行分組，分別用25、50、100、200 μmol·L-1白藜蘆醇處理宮頸癌Hela細胞24、48、72 h，以培養基代替白黎蘆醇作為空白對照組；用已知PDCD5陽性表達的正常宮頸組織切片做陽性對照[5]。

1.2.2 原位雜交 采用原位雜交檢測宮頸癌Hela細胞中PDCD5 mRNA表達，用RNase酶(0.1 g·L-1)預處理細胞滴片，酶解細胞內的mRNA，嚴格按操作步驟進行。用無探針的雜交液作為空白對照組，用已知PDCD5陽性表達的正常宮頸組織切片作為陽性對照。

1.2.3 免疫細胞化學和原位雜交結果判定 陽性信號均定位于宮頸癌Hela細胞的細胞質中，免疫細胞化學強陽性染色為黃褐色，原位雜交強陽性染色為紫藍色，每張滴片隨機選5個視野(100×)，按著色深淺和陽性細胞百分比來判定結果[5-7]：1)陽性細胞數：<1%為0分，1%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分；2)細胞著色強度的計分：無染色為0分，淡黃色或淡藍色為1分，棕黃色或藍色為2分，棕褐色或紫藍色為3分。綜合2項得分進行結果判定。

1.2.4 TUNEL法 采用TUNEL法檢測宮頸癌Hela細胞凋亡情況，宮頸癌Hela細胞的細胞核呈黃褐色為凋亡陽性，細胞核不染色為陰性。以公式計算凋亡指數[6]。

2 結果

2.1白黎蘆醇對宮頸癌Hela細胞中PDCD5蛋白、mRNA表達的影響4種不同濃度的白黎蘆醇分別處理宮頸癌Hela細胞24、48、72 h后，與空白對照組比較，PDCD5蛋白、mRNA的表達均有明顯升高，且白藜蘆醇的濃度越高，其表達也越高，差異均有統計學意義(P均<0.05)；同一濃度白藜蘆醇處理組中，隨著時間延長，PDCD5蛋白、mRNA的表達也均升高，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

2.2白黎蘆醇對宮頸癌Hela細胞凋亡的影響4種不同濃度的白黎蘆醇分別處理宮頸癌Hela細胞24、48、72 h后，與空白對照組比較，細胞凋亡指數明顯增加，且隨白藜蘆醇的濃度的增加而升高，差異有統計學意義(P<0.05)；但同一濃度白藜蘆醇處理組細胞凋亡指數隨白藜蘆醇的作用時間延長增加均不顯著，差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表1 白黎蘆醇對宮頸癌Hela細胞PDCD5蛋白、mRNA表達的影響

表2 白藜蘆醇對宮頸癌Hela細胞凋亡的影響

3 討論

白藜蘆醇屬于多酚類化學物，在虎杖、花生、葡萄等植物內含量較高。有研究[8]證實白藜蘆醇有抗炎、抗血小板聚集、清除自由基、抗氧化、心血管保護、誘導腫瘤細胞凋亡及抗腫瘤增殖等作用。關于白藜蘆醇對腫瘤作用的研究[9]證實，白藜蘆醇對乳腺癌、卵巢癌、肝癌、膠質母細胞瘤、前列腺癌、結腸癌等都有一定的抗腫瘤作用，可以抑制腫瘤細胞的生長并促進其凋亡。

細胞凋亡過程的紊亂與許多腫瘤的發生有直接或間接的關系。PDCD5基因在細胞的凋亡過程中起著關鍵性作用，可以誘導和促進凋亡。PDCD5在人體正常的睪丸、腎上腺、胎盤、腎臟等組織中高表達，而在胚胎組織、腫瘤組織中低表達或不表達[10]。

本實驗中我們用不同濃度的白藜蘆醇處理宮頸癌Hela細胞，不同時間段不同濃度白藜蘆醇組PDCD5蛋白、mRNA表達均有增高，說明白藜蘆醇可以通過上調宮頸癌Hela細胞中PDCD5的表達而促進腫瘤細胞凋亡。我們用TUNEL方法檢測白藜蘆醇處理宮頸癌Hela細胞凋亡情況，證實白藜蘆醇可以提高宮頸癌Hela細胞的凋亡指數，說明白藜蘆醇在體外可以促進宮頸癌Hela細胞凋亡。

綜上所述，白藜蘆醇可以通過上調宮頸癌Hela細胞中PDCD5的表達，促進和誘導宮頸癌Hela細胞的凋亡，從而有望成為宮頸癌治療新的輔助方法。