睪酮通過PI3K/mTOR信號通路促進子宮內膜癌細胞增殖的機制研究

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(1.常州市第一人民醫院婦科，江蘇 常州 213000；2.常州市第一人民醫院綜合實驗室，江蘇 常州 213000)

子宮內膜癌是嚴重威脅女性健康的婦科惡性腫瘤。最近的統計數據表明子宮內膜癌的發病率逐年上升，目前發病率位于婦科惡性腫瘤第4位[1]。子宮內膜癌的發生與多種因素相關[2]，睪酮可能是其中一種。睪酮是一種雄性激素，主要由男性的睪丸或女性的卵巢分泌，腎上腺也可以少量分泌[3-4]。睪酮具有多種生理學功能，但是最近的研究[5-7]表明，睪酮的表達水平與多種疾病的發生、發展和預后具有高度相關性，包括心血管疾病、抑郁癥、肥胖以及前列腺癌等。但是目前關于睪酮與子宮內膜癌之間的相關性未有報道，因此本研究通過一系列實驗探索睪酮對子宮內膜癌細胞增殖的影響以及其對PI3K/mTOR信號通路關鍵蛋白表達的影響[8]，以此探索子宮內膜癌潛在的治療手段。

1 材料與方法

1.1細胞來源子宮內膜癌Ishikawa細胞株購自中國醫學科學院上海細胞庫。

1.2主要試劑睪酮購自江蘇安特爾醫療科技有限公司，為口服用膠囊，用時取膠囊內液體進行稀釋；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白(Bax)、β-actin、PI3K、mTOR、p-PI3K、p-mTOR兔抗人一抗以及辣根過氧化物酶(HRP)偶聯羊抗兔二抗購自美國CST公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Total RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒和SYRB購自日本TAKARA公司；DMEM F12培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gbico公司。

1.3方法

1.3.1 細胞培養 常規培養子宮內膜癌Ishikawa細胞于含有體積分數10%胎牛血清和質量分數1%青鏈霉素混合液的DMEM F12完全培養基中，置于細胞孵育箱內，保持37 ℃恒溫，體積分數5% CO2濃度以及飽和濕度。在倒置顯微鏡下觀察細胞密度，細胞生長至80%～90%密度進行消化傳代。

1.3.2 細胞增殖檢測(CCK-8法) 子宮內膜癌Ishikawa細胞消化重懸后以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設置3個復孔，適應生長過夜后，加入終濃度為10、20、40、80 ng·mL-1的睪酮處理48 h，以未加睪酮的細胞作為陰性對照。加入體積分數10% CCK-8試劑共同孵育3 h后，置于酶標儀中在450 nm波長處檢測各孔吸光度。

細胞如上鋪板適應生長后，加入終濃度為40 ng·mL-1的睪酮處理7 d，每天同一時間按照上述方法檢測1次吸光度值，以未加睪酮的細胞作為陰性對照，7 d后繪制細胞生長曲線。

1.3.3 qPCR法檢測 子宮內膜癌Ishikawa細胞消化重懸后以5×105個/孔的密度接種于6孔板中，適應生長過夜后，加入終濃度為40 ng·mL-1的睪酮處理48 h，以未加睪酮的細胞作為陰性對照，按照總RNA提取試劑盒說明書操作，提取細胞總RNA。吸光度法檢測RNA濃度，按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，構建cDNA。加入相應試劑和熒光染料SYRB后，用美國BIO-RED公司實時熒光定量PCR儀器進行檢測，實驗程序為：95 ℃預變性15 s；95 ℃變性5 s；65 ℃退火30 s；40個循環。最后結果以2-△△ct進行計算。實驗重復3次。引物序列如下所示：β-actin：上游CTCCATCCTGGCCTCGCTGT，下游GCTGTCACCTTCACCGTTCC；Bax：上游ACCAAGAAGCTGAGCGAGTG，下游CCCAGTTGAAGTTGCCATCA；Bcl-2：上游ACGACTTCTCCCGCCGCTAC，下游CCCAGCCTCCGTTATCCTG。

1.3.4 Western blot 子宮內膜癌Ishikawa細胞消化重懸后以5×105個/孔的密度接種于6孔板中，適應生長過夜后，加入終濃度為40 ng·mL-1的睪酮處理48 h，以未加睪酮的細胞作為陰性對照，加入相應體積的RIPA-PMSF-磷酸酶抑制劑混合液提取細胞總蛋白。通過BCA法檢測蛋白濃度，加入相應體積的上樣緩沖液后煮沸5 min變性蛋白，于-20 ℃保存。配制SDS-PAGE凝膠后，以每孔30 μg的上樣量加入變性蛋白溶液進行分離，轉移進入PVDF膜上，使用質量分數5%牛血清白蛋白常溫封閉2 h，切膜后分別加入已經稀釋完畢的β-actin、Bcl-2、Bax、PI3K、p-PI3K、mTOR、p-mTOR兔抗人一抗，4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次后加入已經稀釋完畢的HRP偶聯羊抗兔二抗，室溫孵育2 h。用TBST清洗3次后浸泡于TBST中，使用專用的ECL進行曝光。實驗重復3次。最終以Actin作為內參，統計各組蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1不同濃度睪酮促進子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖常規培養子宮內膜癌Ishikawa細胞后，用不同濃度的睪酮處理，結果證實，睪酮以劑量依賴性的方式促進腫瘤細胞的增殖(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度睪酮對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖的影響

2.2固定濃度睪酮顯著促進子宮內膜癌Ishikawa細胞倍增時間常規培養子宮內膜癌Ishikawa細胞后，用40 ng·mL-1的睪酮處理5 d，結果證實，睪酮能夠促進腫瘤細胞的增殖，降低其倍增時間(P<0.05)。見圖1。

圖1 睪酮作用不同時間對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖的影響

2.3睪酮對子宮內膜癌Ishikawa細胞凋亡相關基因表達的影響常規培養子宮內膜癌Ishikawa細胞后，用40 ng·mL-1的睪酮處理48 h，提取總蛋白和總RNA后，檢測凋亡相關基因的表達水平。結果證實，無論是在轉錄水平還是翻譯水平，睪酮都能夠上調腫瘤細胞Bcl-2的表達水平，而降低Bax的表達水平。見圖2、表2。

圖2 睪酮對子宮內膜癌Ishikawa細胞凋亡相關基因表達的影響

表2 睪酮對子宮內膜癌Ishikawa細胞凋亡相關基因表達的影響

2.4睪酮對子宮內膜癌Ishikawa細胞PI3K/mTOR信號通路的影響常規培養子宮內膜癌Ishikawa細胞后，用40 ng·mL-1的睪酮處理48 h，提取總蛋白后，檢測PI3K/mTOR信號通路活化水平。結果證實，睪酮能夠促進腫瘤細胞PI3K和mTOR的磷酸化(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 睪酮對子宮內膜癌Ishikawa細胞PI3K/mTO信號通路蛋白活化的影響

表3 睪酮對子宮內膜癌Ishikawa細胞PI3K/mTOR信號通路蛋白活化的影響

注：與陰性對照組比較，1)P<0.05

3 討論

子宮內膜癌是常見的婦科腫瘤，其發生與多種因素相關[9-11]。睪酮在多種惡性腫瘤，尤其是在前列腺癌的發生、發展中扮演了重要角色[5,7]。先前的研究[5,7,12]表明高水平的睪酮能夠促進前列腺癌的發生以及骨轉移，前列腺癌患者去勢對于前列腺癌的治療也具有重要意義。但是睪酮在婦科腫瘤，尤其是子宮內膜癌中的意義目前尚無報道，本研究旨在證實兩者之間的聯系并探索睪酮促進子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖的效應和分子機制。

子宮內膜癌可以分為雌激素受體依賴型以及非依賴型[11]，雌激素受體依賴型以陽性表達雌激素受體為特征。子宮內膜癌Ishikawa細胞是雌激素受體依賴型子宮內膜癌的代表性細胞株[13-14]，本研究通過CCK-8法觀察到不同濃度的睪酮能夠提升子宮內膜癌Ishikawa細胞的增殖。使用固定濃度的睪酮作用于細胞不同時間，通過繪制的生長曲線可以發現，睪酮作用后顯著縮短了細胞倍增時間，這初步證實了睪酮與子宮內膜癌之間的關聯。

蛋白表達檢測證實睪酮作用后顯著上調了凋亡抑制基因Bcl-2的表達水平，顯著下調了凋亡促進基因Bax的表達水平。該結果提示睪酮可能通過抑制細胞的凋亡而促進增殖，這與先前研究[15-16]相似。在更進一步的研究中，發現睪酮作用后PI3K/mTOR信號通路的關鍵分子p-PI3K和p-mTOR的活化水平顯著上調，但是PI3K和mTOR的表達水平未受到影響，因此推測睪酮通過激活PI3K/mTOR信號通路促進Bcl-2的表達水平，同時抑制Bax的表達水平，最終促進子宮內膜癌子宮內膜癌Ishikawa細胞的增殖。