表皮生長因子受體及血漿miR相關指標在卵巢癌中的表達及其臨床意義

(駐馬店市第一人民醫院婦產科，河南 駐馬店 463000)

卵巢癌是常見的女性惡性腫瘤之一，發病率和致死率占婦科腫瘤的前3位[1-3]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)和miR相關指標在多種惡性腫瘤中均具有較高的診斷價值[4]。本文應用熒光定量PCR法和免疫組化方法測定了EGFR及血漿miR相關指標在卵巢癌中的表達，分析其與卵巢癌臨床病理特征的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選取本院2015年10月至2016年10月收治的50例卵巢癌患者，年齡20～73歲，中位年齡48歲；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期患者28例，Ⅲ、Ⅳ期患者22例；漿液性腺癌患者19例，黏液性腺癌患者18例，其他患者13例；低分化20例，中分化19例，高分化11例。同時選取同一時間段到本院就診的正常卵巢者(子宮肌瘤同時行附件切除的正常卵巢組織)15例。所有患者在手術前均未接受任何放、化療治療，并經病理學確診。

1.2主要試劑與儀器主要試劑：Trizol(美國Invitrogen公司)，dNTP Mixture、Oligo(dT)18、Quantitative Real-time PCR檢測試劑盒(日本TaKaRa公司)，RNase Inhibitor、逆轉錄酶M-MuLV、RNaseA(美國Promega公司)、EGFR鼠抗人單克隆抗體(深圳欣博盛生物科技有限公司)。

主要儀器：Prism?7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，METTER AE260型電子天平(德國Deltalange公司)，TGL-16型高速臺式離心機(上海醫療器械六廠)。

1.3方法

1.3.1 熒光定量PCR法測定EGFR、血漿miR相關指標(miR-205、miR-20a及miR-29c)的mRNA水平 收集50例卵巢癌患者、15例正常卵巢者手術切除的標本，并抽取上述研究對象空腹時的外周靜脈血，分別采用Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度及濃度，Oligo(dT)18為引物，在M-MLV反轉錄酶作用下進行cDNA的合成。在GenBank中檢索得到人源β-actin(內參基因)、EGFR、miR-205、miR-20a及miR-29c基因序列，利用Premier 5.0引物設計軟件設計出PCR檢測引物，以上述cDNA為模板，采取熒光定量PCR法測定EGFR、miR-205、miR-20a及miR-29c的mRNA水平。

1.3.2 免疫組化方法測定EGFR蛋白在卵巢癌組織中的表達 所有組織標本均經福爾馬林固定、石蠟包埋后制作為4 μm的連續切片，嚴格按照試劑說明書進行HE染色和免疫組化S-P法染色，并設置陰性對照(以PBS代替一抗)和陽性對照(已知陽性切片)。結果判斷：細胞質或細胞膜上出現的棕黃色顆粒即為EGFR蛋白；根據染色細胞所占比例：0分代表無陽性細胞，1分代表陽性細胞占1%～10%，2分代表陽性細胞占11%～50%，3分代表陽性細胞占51%～75%，3分代表陽性細胞占>76%。根據染色強度評分：0分代表無染色，1分代表淡黃色，2分代表淡黃色，3分代表棕褐色。然后計算2個評分之和，0～1分為(-)，2～3分為(+)，4～5分為(++)，6～7分為(+++)，將(-)與(+)定為陰性，(++)與(+++)定為陽性。

2 結果

2.1EGFR及血漿miR相關指標的mRNA在卵巢癌及正常卵巢患者中的表達EGFR mRNA、miR-205 mRNA、miR-20a mRNA及miR-29c mRNA(0.83±0.12，0.71±0.08，3.64±0.23，0.68±0.05)在卵巢癌患者中的相對表達量均明顯高于正常卵巢者(0.38±0.06，0.24±0.07，1.17±0.11，0.18±0.03)，差異均有統計學意義(t=13.954,P<0.001；t=20.497,P<0.001；t=40.705,P<0.001；t=36.676,P<0.001)。

2.2EGFR蛋白在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達EGFR蛋白在卵巢癌組織中的陽性率(60.00%)明顯高于正常卵巢組織(13.33%)，差異有統計學意義(χ2=7.386，P=0.007)。見表1。

表1 EGFR蛋白在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達

2.3EGFR在卵巢癌患者中的表達與臨床病理特征之間的關系Ⅰ、Ⅱ期以及中、高分化卵巢癌患者的EGFR mRNA相對表達量(0.66±0.14，0.74±0.14)明顯低于Ⅲ、Ⅳ期以及低分化患者(0.85±0.16，0.88±0.15)，差異均有統計學意義(t=4.473,P<0.001；t=3.367,P=0.001)。Ⅰ、Ⅱ期及中、高分化的EGFR蛋白陽性比例(35.71%，46.67%)明顯低于Ⅲ、Ⅳ期及低分化(90.91%，80.00%)，差異均有統計學意義(χ2=15.639，P<0.001；χ2=5.556，P=0.018)。見表2。

表2 EGFR在卵巢癌患者中的表達與臨床病理特征之間的關系

2.4血漿miR相關指標在卵巢癌患者中的表達與臨床病理特征之間的關系Ⅰ、Ⅱ期以及中、高分化卵巢癌患者的miR-205 mRNA、miR-20a mRNA及miR-29c mRNA相對表達量(0.33±0.04、1.25±0.14、0.27±0.03以及0.37±0.04、1.26±0.11、0.26±0.03)明顯低于Ⅲ、Ⅳ期以及低分化(0.63±0.05、4.04±0.20、0.61±0.04以及0.65±0.06、4.17±0.21、0.63±0.04)，差異均有統計學意義(t=23.583、P<0.001，t=55.598、P<0.001，t=33.201、P<0.001；t=18.330、P<0.001，t=56.979、P<0.001，t=35.278、P<0.001)。見表3。

表3 血漿miR相關指標在卵巢癌患者中的表達與臨床病理特征之間的關系

3 討論

EGFR作為一類酪氨酸激酶受體，能夠進行細胞信號傳遞[5-6]。已有研究[7-8]證實，EGFR過度表達引起細胞持續增殖，促進細胞發生惡性轉化，與卵巢癌密切相關。在惡性腫瘤患者中，通過人為干預使EGFR降低后，可以明顯改善患者的病情。miR指標是目前臨床上針對各類腫瘤患者中研究比較熱門的指標之一，尤其是miR-205、miR-20a及miR-29c，這些指標同時具有原癌與抑癌雙重作用，在卵巢癌中的相關研究資料較為少見[9]。

本研究應用熒光定量PCR法和免疫組化方法測定了卵巢癌患者中EGFR的mRNA和蛋白表達以及血漿miR相關指標(miR-205、miR-20a及miR-29c)的mRNA水平。結果顯示，EGFR mRNA及蛋白、miR-205 mRNA、miR-20a mRNA及miR-29c mRNA在卵巢癌患者中的相對表達量均明顯高于正常卵巢者。而且臨床分期越晚，組織分化程度越低，其EGFR mRNA、miR-205 mRNA、miR-20a mRNA及miR-29c mRNA的相對表達量越高，EGFR蛋白的陽性率也越高。這提示EGFR與血漿miR相關指標表達越強，卵巢癌惡性程度越高，充分說明EGFR與血漿miR相關指標與卵巢癌的臨床分期與分化程度密切相關。因此EGFR與血漿miR相關指標均能作為判斷卵巢癌的指標，聯合檢測EGFR與血漿miR相關指標有助于卵巢癌的早期診斷，及早進行針對性治療。

綜上所述，EGFR與血漿miR相關指標均與卵巢癌的發生均有密切的關系，對于卵巢癌的臨床分期與分化程度具有較高的檢測意義。