模擬高原缺氧環(huán)境對不同性別大鼠生理生化指標的影響

何 蕾，馬慧萍，景臨林，張冬梅，賈正平

高原地區(qū)由于空氣稀薄，易造成初入高原人群身體不適。其中生理變化包括血氧飽和度下降，紅細胞增多，血液黏稠度增加，血液流變學改變，進而影響全身組織器官[1-2]。同時由于機體氧供應不足，造成活性氧(ROS)增加，氧化應激反應可使組織損傷進一步加重，尤其對氧敏感的腦和心肌組織易損性增加[3]。高原缺氧環(huán)境嚴重影響高原地區(qū)建設(shè)、國防軍事安全和人民身體健康。目前對高原反應預防治療的研究越來越多，但是其機制仍不清楚。有研究表明，很多疾病的發(fā)生、發(fā)展及愈后都與性別密切相關(guān)，這種性別差異表現(xiàn)出不同的臨床表現(xiàn)及愈后，但關(guān)于性別對高原缺氧耐受的影響未見報道[4]。本研究以健康Wistar大鼠為實驗對象，采用低壓低氧艙模擬海拔8000 m高原環(huán)境，通過比較模擬高原缺氧與正常大鼠的血液流變學、組織病理和生化指標，探討不同缺氧時間后生理生化指標的變化情況，旨在研究低氧對機體的影響，并探討大鼠性別與高原缺氧耐受性的關(guān)系。以期為預防和治療高原反應提供幫助。

1 材料與方法

1.1實驗儀器 MVIS 2030全自動血流變分析儀(重慶天?？萍加邢薰?，F(xiàn)LYDWC50-ⅡC低壓低氧動物實驗艙(貴州風雷航空軍械有限公司)，BP210S電子天平(荷蘭賽多利斯有限公司)，低溫離心機(德國赫利氏公司)，DK-8A型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，tissuelyser-24組織勻漿機(上海凈信有限公司)，Spectra Max i3酶標儀(奧地利Molecular Devices公司)。

1.2實驗動物 SPF級Wistar大鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±25)g，由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK2014-0020。在恒溫(21～23℃)、恒濕(45%～65%)、明暗各12 h周期的飼養(yǎng)室，全價顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進食和飲水。

1.3實驗試劑 BCA法蛋白測定試劑盒(批號：20170312)，丙二醛(MDA)測定試劑盒(批號：20170413)，一氧化氮(NO)測定試劑盒(批號：20170406)，一氧化氮合成酶(NOS)測定試劑盒(批號：20170306)，過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(批號：20170512)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒(批號：20170312)，超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(批號：20170413)，Na+-K+-ATP酶活力測定試劑盒(批號：20170512)。

1.4減壓缺氧損傷模型實驗 將100只Wistar大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組，缺氧1、3、5和10 d組，每組20只，雌雄各10只，分籠飼養(yǎng)并標記。將各缺氧組放入大型低壓氧艙內(nèi)，以10 m/s速度升至海拔8000 m，分別停留1 d、3 d、5 d和10 d后，取出大鼠，采集動脈血，進行血液流變學指標的測定；采集大鼠腦組織和心肌組織，進行組織病理觀察和生化指標測定；正常組在艙外飼養(yǎng)，同法處理，測定血液流變學指標，組織病理觀察和生化指標測定。

1.5觀察指標 ①血液流變學指標檢測：各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛1 ml麻醉后，解剖腹腔，采集腹主動脈血4 ml，立即進行血液流變學分析；隨后離心取上層血清，進行血清分析；測定指標包括全血黏度、血漿黏度、紅細胞聚集指數(shù)、卡松黏度、屈服應力、紅細胞內(nèi)黏度。②病理組織檢測：取減壓缺氧實驗組大鼠腦和心肌組織，清洗，10%甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，染色和觀察，記錄實驗結(jié)果。③大鼠腦組織生化指標檢測：取減壓缺氧實驗大鼠腦組織，預冷生理鹽水清洗后精密稱量100 mg，按1∶10(m/v)加入4℃的生理鹽水，進行組織勻漿1 min，得到10%組織勻漿液。將組織勻漿液放入低溫離心機，在4℃下，3000 r/min離心10 min，離心后吸取上清液，按照試劑盒說明書操作，進行MDA、SOD、CAT、GSH-PX、NO、NOS和Na+-K+-ATP酶的測定。

2 結(jié)果

2.1血液流變學指標 與正常組比較，缺氧3、5和10 d組雌鼠全血黏度、卡松黏度和屈服應力顯著升高(P<0.01)，雄鼠全血黏度、血漿黏度和屈服應力也顯著升高(P<0.05，P<0.01)；其中雄鼠的全血黏度和屈服應力較雌鼠增高顯著(P<0.05,P<0.01)。與正常組比較，缺氧3 d組雄鼠紅細胞聚集指數(shù)顯著升高(P<0.05)，缺氧10 d組雄鼠卡松黏度顯著升高(P<0.05)，缺氧3和5 d組雄鼠紅細胞內(nèi)黏度顯著降低(P<0.05，P<0.01)。而各缺氧組雌鼠血漿黏度、紅細胞聚集指數(shù)和紅細胞內(nèi)黏度與正常組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2大鼠腦和心肌組織病理結(jié)果 正常組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常，可見血管和細胞形態(tài)正常；各缺氧模型組大鼠腦組織有明顯的細胞核固縮，細胞間隙明顯增大，組織空泡增多，且隨缺氧時間增加而愈發(fā)嚴重。見圖1。正常組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，細胞形態(tài)完好；各缺氧模型組大鼠心肌組織細胞排列紊亂，肌纖維增粗，有炎性因子產(chǎn)生，肌細胞腫脹，且隨缺氧時間增加而愈發(fā)嚴重。見圖2。

2.3腦組織生化指標比較 與正常組比較，各缺氧組雌鼠和雄鼠腦組織中CAT、SOD、GSH-PX、NOS和NO均隨缺氧時間延長逐漸降低(P<0.05)，且雄鼠的下降更為明顯。與正常組比較，各缺氧組雌鼠和雄鼠腦組織中MDA隨缺氧時間延長顯著升高(P<0.05)，而Na+-K+-ATP酶在初期缺氧時顯著下降(P<0.05)，第10天時恢復至正常水平，且雌鼠下降更為明顯。見圖3。

表1 5組大鼠的血液流變學指標比較

圖1 5組大鼠腦組織病理變化(HE ×200)

圖2 5組大鼠心肌組織病理變化(HE ×200)

3 討論

高原缺氧能使體內(nèi)紅細胞增多，引起血液循環(huán)障礙，其中尤以血液黏度為重要變化指標[5]。血液黏度的低與高代表循環(huán)功能的優(yōu)與劣或血液供應的多與少，血液黏度增加，循環(huán)阻力升高，血流速度減慢，必然導致器官和組織的血液灌流量下降，造成缺血缺氧，影響組織的代謝和功能，從而產(chǎn)生高原反應[6-7]。血液流變學分析是評價機體血液流動和細胞變形，血液與血管和心臟之間相互作用的主要方法。因此，通過血液流變學檢測，能對高原病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸以及預后提供可靠的依據(jù)。

本組實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠全血黏度均有顯著性升高，表明缺氧會增加血液黏度，雌鼠血漿黏度無顯著性變化而卡松黏度和屈服應力有顯著升高，其原因可能是由紅細胞增多及變形引起的[8]；而雄鼠血漿黏度、卡松黏度和屈服應力均有顯著升高，表明除紅細胞增多及變形外血漿蛋白和血脂可能升高[9]。雄鼠血液黏度比雌鼠升高更明顯，可能與激素水平有差異相關(guān)。因此，對高原缺氧人群及時及早發(fā)現(xiàn)在血液流變學異常的可逆階段，并及時降低血液黏稠度，減少紅細胞，可以逆轉(zhuǎn)此過程，阻止疾病進一步發(fā)展，對男性而言尤其重要。

腦和心肌組織是對氧最為敏感的兩大器官，本實驗HE染色結(jié)果顯示，正常大鼠腦和心肌組織結(jié)構(gòu)正常，無明顯病理改變。而各缺氧組大鼠的腦組織有明顯的細胞核固縮，細胞間隙明顯增大，組織空泡增多；心肌組織疏松水腫，血管擴張，毛細血管增多，炎性細胞浸潤。均隨缺氧時間增加而愈發(fā)嚴重。表明高原缺氧會造成組織病理學改變，損傷機體器官功能。

在高原缺氧的發(fā)生發(fā)展過程中，氧化應激和能量代謝的作用至關(guān)重要。機體在高原缺氧條件下產(chǎn)生大量ROS，ROS能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，形成脂質(zhì)過氧化物MDA，具有細胞毒性，能引起細胞代謝及功能障礙，甚至死亡[10-11]。MDA含量可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應程度，間接提示細胞損傷程度。而SOD和CAT是體內(nèi)天然存在的自由基清除物質(zhì)，對氧化與抗氧化平衡起至關(guān)重要的作用。GSH-PX能特異性催化GSH對氫氧化物的還原反應，其活力的升高有利于機體清除ROS和保護機體組織細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性[12-14]。結(jié)合實驗結(jié)果，各缺氧組大鼠腦組織中MDA含量隨著缺氧時間的延長顯著增加，SOD、CAT、GSH-PX水平隨著缺氧時間的延長均明顯降低。表明高原缺氧使抗氧化酶活力降低，脂質(zhì)過氧化反應增加，機體氧化與抗氧化平衡受到破壞，導致細胞膜基本結(jié)構(gòu)改變，進一步影響細胞功能，致使細胞損傷甚至死亡，從而破壞腦組織功能，影響認知。

機體的主要能量供應是ATP，在高原缺氧環(huán)境下，體內(nèi)ATP含量降低，造成能量供應不足，引發(fā)疲勞感[15]。NO是血管內(nèi)皮舒張因子，NOS是NO合成的限速酶。低氧時腦組織產(chǎn)生強烈的脂質(zhì)過氧化反應，降低NOS活性，同時NO的合成和釋放減少，最終導致血管收縮增強，腦動脈壓升高[16]。本實驗結(jié)果顯示，在缺氧條件下，Na+-K+-ATP酶活性先降低后恢復，其中雌鼠較雄鼠降低更明顯，可能與激素有關(guān)；NO含量和NOS活力均有顯著性下降，且雄鼠下降更加明顯，表明雄鼠可能血管收縮更為顯著，出現(xiàn)高原頭痛癥狀的可能性更大。

綜上所述，高原缺氧可引起腦和心肌組織損傷，可能是由血液黏稠和氧化應激反應引起的。且雌鼠和雄鼠在指標上具有一定差異，這可能與雌激素具有擴張血管、抗炎、抗氧化的作用有關(guān)。其具體損傷機制有待于進一步深入研究。