氨氮脅迫與恢復對羅氏沼蝦幼蝦非特異性免疫的影響

董學興,呂林蘭,趙衛紅,陸 妍，劉其根

(1. 上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306； 2. 鹽城工學院海洋技術系，江蘇省沿海池塘養殖生態重點實驗室， 江蘇鹽城 224051)

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)又稱馬來西亞大蝦或泰國蝦，具有食性廣、生長快、營養豐富、抗病力強等優良養殖性能，是我國養殖的主要淡水蝦品種之一。近年來隨著水產養殖技術水平的提高，放養密度加大，從而導致單位水體中養殖動物排泄物及殘餌等有機物積聚，分解生成大量氨氮，使得養殖環境持續惡化，對養殖動物的生存、生長、發育構成威脅，造成疾病頻繁爆發，嚴重制約著我國對蝦養殖業可持續發展。水體中的氨包括離子氨和非離子氨，對水產動物有毒性的主要為非離子氨。離子氨和非離子氨可以相互轉化，其比例主要取決于水溫和pH。水中非離子氨含量隨溫度和pH升高而增加，對水產動物的毒性隨之增大。當對蝦暴露于氨氮時，其體內產生大量超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH)、過氧化氫(H2O2)等氧自由基(ROS)，而氧自由基超過機體抗氧化耐受能力時便會影響機體抗氧化酶系統，產生氧化脅迫[1-2]。研究表明，非離子氨能直接損害蝦類鰓組織，并影響其滲透調節、蛻殼和免疫功能，從而抑制生長、降低存活率[3-4]。已有研究表明，羅氏沼蝦在高濃度氨氮作用下抗病力明顯降低，感染病原菌的幾率增加[5-6]。關于氨氮對蝦類抗氧化影響的研究，目前主要集中于探索氨氮持續脅迫條件下不同時間點蝦類抗氧化酶的變化規律[7-10]。在實際養殖生產中，夏季水體溫度、pH晝夜變化較大，池水非離子氨常處于動態變化中。因此，本文研究了非離子氨對羅氏沼蝦幼蝦的急性毒性，以及氨氮脅迫48 h后恢復48 h對羅氏沼蝦幼蝦抗氧化酶的影響，以期為羅氏沼蝦健康養殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗幼蝦購自江蘇省鹽城市射陽縣林盛蝦苗場，蝦體長(2.0±0.4) cm，體質量(0.16±0.06) g。

1.2 氨氮急性毒性實驗

幼蝦運至實驗室，暫養7 d后進行氨氮脅迫預實驗，得出無效應濃度和最大效應濃度。用氯化銨(分析純)、曝氣48 h的自來水配制氨氮溶液，根據預實驗結果，共設置5個急性毒性實驗濃度梯度，其總氨濃度為0、22.17、32.04 、46.32、66.95 mg·L-1，對應的非離子氨濃度分別為0、1.18、1.70、2.46、3.56 mg·L-1。實驗在玻璃缸中進行，每缸盛3 L實驗液，放10尾蝦，每24 h換實驗液1/2。每個濃度設置3組平行，實驗期間持續充氣，不投喂餌料，水溫保持在(25±1)℃，pH 保持在8.0±0.5，準確記錄24、48、72、96 h死亡數目。

1.3 氨氮亞急性毒性實驗

根據急性毒性實驗96 hLC50結果，設置5個亞急性毒性實驗濃度梯度，總氨濃度為0、8、12、16、20 mg·L-1，對應的非離子氨濃度分別為0、0.43、0.64、0.85、1.06 mg·L-1(其中濃度0為對照組)。亞急性毒性實驗在玻璃缸中進行，每缸盛3 L實驗液，隨機挑選個體均勻的健康羅氏沼蝦幼蝦10尾，每個濃度設置3組平行。氨氮脅迫48 h(24 h 時換實驗液1/2)后將實驗液更換為清水(曝氣48 h的自來水)，恢復48 h。溫度、pH、充氣、投喂等實驗條件同上。脅迫48 h、恢復48 h時分別取幼蝦肌肉組織，保存在-80℃下，用于超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)測定。

1.4 抗氧化酶活性及MDA測定

抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)活性和MDA含量測定采用南京建成生物工程研究所試劑盒，具體操作步驟、計算和單位參照試劑盒說明書。

1.5 數據處理

本實驗中非離子氨計算公式如下[11]：

非離子氨濃度 =總氨氮濃度/[10(pKa-pH)+1]

式中：pKa=0.090 18+2 729.92/T(T為開氏溫度，T=273+t℃)。

氨氮對羅氏沼蝦幼蝦半致死濃度(LC50)：采用SPSS 16.0 Probit分析法計算半數致死濃度和95%置信區間，并按照公式SC= 0.1 × 96 hLC50計算安全濃度。

酶活性差異性分析：采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，若差異顯著(P<0.05)則采用LSD法進行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 氨氮對羅氏沼蝦急性毒性實驗

氨氮對羅氏沼蝦幼蝦急性毒性實驗結果見表1。實驗期間，對照組(非離子氨濃度0)羅氏沼蝦無死亡現象發生。同一時間點，羅氏沼蝦幼蝦死亡率隨氨氮濃度升高而升高。同一濃度下，幼蝦死亡率隨暴露時間延長而上升。氨氮對羅氏沼蝦幼蝦24、48、72、96 h的半致死濃度分別為4.25、2.35、1.86、1.54 mg·L-1，其安全濃度為0.154 mg·L-1(表2)。

表1 氨氮對羅氏沼蝦急性毒性實驗結果Tab.1 Results of acute toxicity test of ammonia-N on M. rosenbergii

表2 氨氮對羅氏沼蝦的半致死濃度和安全濃度Tab.2 LC50 and SC of ammonia-N stress on M. rosenbergii

2.2 氨氮脅迫和恢復對羅氏沼蝦抗氧化酶活性的影響

實驗結果表明(表3)，氨氮脅迫顯著影響羅氏沼蝦SOD活性(P<0.05)，而對CAT和GSH-Px活性影響不顯著(P>0.05)。暴露48 h時，羅氏沼蝦幼蝦SOD活性隨氨氮濃度升高而升高，各氨氮濃度組活性均顯著高于對照組(P<0.05)。其中最高氨濃度(1.06 mg·L-1)組SOD活性是對照組的2.13倍，亦顯著高于其余各處理組(P<0.05)。

恢復48 h時，各組SOD、CAT活性差異顯著(P<0.05)，而各組GSH-Px活性無顯著差異(P>0.05)。同一濃度下，各試驗組SOD活性均較脅迫時顯著下降(P<0.05)，但除0.85 mg·L-1組外，其余試驗組仍顯著高于對照組(P<0.05)。CAT活性則與之相反，除0.85 mg·L-1組顯著低于對照組外(P<0.05)，其余試驗組均與對照組無顯著差異(P>0.05)。與脅迫48 h時相比，0.85、1.06 mg·L-1濃度組CAT活性及0.85 mg·L-1組GSH-Px活性下降顯著(P<0.05)。

2.3 氨氮脅迫和恢復對羅氏沼蝦MDA含量的影響

實驗結果表明(表4)，氨氮對羅氏沼蝦MDA含量有顯著影響(P<0.05)。脅迫48 h，0.43、0.64、1.06 mg·L-1組MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)。解除脅迫后恢復48 h，上述3個濃度組MDA含量均較脅迫時下降，各組MDA含量與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 氨氮對羅氏沼蝦的急性毒性

王龍等[12]研究表明，正常溶氧條件下非離子氨對羅氏沼蝦幼蝦(全長3 cm左右)24 hLC50、48 hLC50、72 hLC50、96 hLC50分別為2.0、1.5、0.97、0.83 mg·L-1，安全濃度為0.083 mg·L-1；而在高溶氧條件下(11 mg·L-1)安全濃度為0.142 5 mg·L-1。另有研究表明，高溶氧可降低非離子氨的毒性[13-14]。本實驗在持續充氣條件下進行，氨氮對羅氏沼蝦安全濃度為0.154 mg·L-1，與上述高溶氧條件下求得的安全濃度接近，說明羅氏沼蝦幼蝦對氨氮具有一定的耐受力。此外，不同規格的蝦對氨的耐受力亦不同，一般而言，個體越大耐受力越強[15-16]。羅氏沼蝦與規格接近的克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)幼蝦(0.016 4～0.021 7 g，SC=0.19 mg·L-1)[17]和中國明對蝦(Penaeuschinensis)(體長3.61 cm，SC=0.16 mg·L-1)[18]對非離子氨的耐受力接近，而小于紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)幼蝦(體長為25～38 mm，SC=0.48 mg·L-1)[15]。本研究結果表明，羅氏沼蝦幼蝦對氨氮的耐受力為中等水平。

表3 氨氮對羅氏沼蝦T-SOD、CAT和GSH-Px活性的影響Tab.3 Effects of ammonia-N on T-SOD, CAT and GSH-Px activity of M. rosenbergii

注：相同小寫字母表示同一時間(同列)各組差異不顯著，否則差異顯著(P<0.05);相同大寫字母表示同一濃度組脅迫48h與恢復48h之間差異不顯著，否則差異顯著(P<0.05)

Notes: The same lowercase mean no significant difference at the same time (the same column), otherwise significant differences(P<0.05); the same capital letter mean no significant difference under the same concentration, otherwise significant differences(P<0.05)

表4 氨氮對羅氏沼蝦MDA含量的影響Tab.4 Effects of ammonia-N on MDA content of M. rosenbergii

注：上標含相同字母表示在同一時間下，各組間差異不顯著，否則差異顯著(P<0.05)

Notes: The same letter mean no significant difference at the same time, otherwise significant differences(P<0.05)

3.2 氨氮脅迫和恢復對羅氏沼蝦抗氧化酶活性的影響

ZHANG等[19]研究表明，隨著氨氮濃度升高，羅氏沼蝦血細胞活性氧(ROS)含量上升。SOD和CAT是生物體內兩種相互關聯的抗氧化酶，可聯合清除活性氧自由基，從而減輕其對機體的損傷。過多的ROS會導致機體脂質過氧化程度加劇，因此，作為脂質過氧化產物之一的MDA，其含量多寡可間接反映機體細胞受氧化損傷的程度[20]。本研究發現，氨氮脅迫48 h，羅氏沼蝦幼蝦SOD活性隨氨氮濃度增大而升高，最高濃度組SOD活性達對照組的2.13倍。除0.85 mg·L-1濃度組外，其余各試驗組MDA含量也顯著升高。據此推測，氨氮脅迫可能致使羅氏沼蝦肌肉組織ROS增多，進而對細胞脂膜產生氧化損傷，機體通過增強SOD活性清除多余的ROS以降低脅迫損傷。任海等[21]發現17.64、34.87 mg·L-1氨氮組脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)肝胰腺SOD活性在6～48 h 均顯著高于對照組(P<0.05)，但72 h時SOD 活性受到顯著抑制。包杰等[22]研究證實，氨氮脅迫中華小長臂蝦(Palaemonetessinensis)24 h對其肝胰腺SOD酶活性具有誘導作用，而48 h時則下降。本實驗設置的5個氨氮濃度均在96 hLC50以下，脅迫48 h時各試驗組羅氏沼蝦SOD活性均受到不同程度的誘導。由此可見，氨氮對甲殼動物SOD活性的影響與動物種類、氨氮濃度、脅迫時間等因素密切相關，當脅迫壓力超過其耐受能力時，SOD活性受到抑制。

當組織中活性氧含量異常升高，生物體通常首先通過SOD催化超氧自由基的歧化反應生成H2O2，進而再被GPx、CAT和過氧化物酶(Prx)等一系列抗氧化酶催化生成無害的H2O與O2[23]。本實驗中，氨氮脅迫48 h對羅氏沼蝦CAT和GSH-Px影響不顯著(P>0.05)，與蔣琦辰等[24]發現氨氮脅迫72 h對紅螯螯蝦SOD影響顯著(P<0.05)、而對CAT和GSH-Px影響不顯著的結果一致(P>0.05)。解除脅迫后恢復48 h，各組CAT、GSH-Px、SOD與脅迫時相比均呈下降趨勢，說明氨氮對CAT、GSH-Px也具有影響，但較SOD對氨氮脅迫的反應可能更為滯后。曾媛媛等[25]在對擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)的研究中也有相似的結果，即氨氮脅迫48 h時鰓SOD活性最高，而GPX活性則是在72 h時才達到最高。

迄今，關于氨氮脅迫后恢復對水產動物抗氧化酶活性影響的研究鮮有報道。本實驗研究表明，氨氮脅迫48 h后恢復48 h，雖然除0.85 mg·L-1組外的其余試驗組SOD活性仍高于對照組，但均較脅迫狀態顯著下降(P<0.05)，MDA含量亦降低到對照組水平。由此可見，在本實驗設置的氨氮濃度范圍內，短期脅迫對羅氏沼蝦的氧化損傷在脅迫結束后可修復，但肌肉仍處于應激狀態。另有研究發現，8、12、16 mg·L-1氨氮脅迫72 h后恢復7 d，紅螯光殼螯蝦(Cheraxquadricarinatus)總SOD活性顯著上升(P<0.05)，因此研究者認為7 d恢復時間不足以讓紅螯光殼螯蝦從脅迫中完全恢復[24]，這與本研究羅氏沼蝦恢復48 h SOD活性仍高于對照的結果類似。張武肖等[26]研究證實，隨著氨氮脅迫時間延長，團頭魴(Megalobramaamblycephala)鰓、肝和腎組織受到的損害增加，經過96 h的恢復期仍未從脅迫中完全恢復，腎組織恢復能力最差。本實驗以MDA和SOD為主要指標，發現氨氮短期(48 h)脅迫造成羅氏沼蝦肌肉氧化損傷，而經過一定恢復期后其氧化損傷可修復。但是，氨氮脅迫是否會造成羅氏沼蝦組織損傷，以及其組織損傷是否可通過解除脅迫得以修復，還需要進一步研究。