五味子乙素抑制晶狀體氧化損傷的實(shí)驗(yàn)研究

王輝，李璐，劉平，劉娟

隨著年齡增加或者日照時(shí)間延長(zhǎng)，積累性氧化損傷引起過(guò)氧化氫（H2O2）過(guò)度產(chǎn)生，大量的活性氧（reactive oxygen species,ROS）、羥基自由基及離子代謝產(chǎn)物堆積，導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，引發(fā)白內(nèi)障[1]。五味子乙素（schisandrin B,Sch B）由于其具有強(qiáng)大的抗氧化、抗炎、降血糖、改善微循環(huán)和抗腫瘤作用而被用于治療各種全身性疾病[2-3]。然而，關(guān)于五味子乙素對(duì)白內(nèi)障大鼠晶狀體保護(hù)作用的研究并不多見(jiàn)。本研究通過(guò)制備氧化損傷誘導(dǎo)的白內(nèi)障大鼠模型，觀察五味子乙素對(duì)白內(nèi)障大鼠晶狀體的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制，為治療白內(nèi)障提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要材料

4周齡清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。五味子乙素（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所），H2O2（上海試劑總廠），血紅素加氧酶-1（heme oxygenase 1,HO-1）、核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子 2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf-2）抗體 （上海碧云天公司），Medium 199（M199）培養(yǎng)基 （美國(guó)GIBCO公司），手術(shù)顯微鏡（Leica），二喹啉甲酸（bicichoninic acid,BCA）蛋白測(cè)定試劑盒、聚偏二氟乙烯 （polyvinylidene fluoride,PVDF）膜及化學(xué)發(fā)光試劑（上海碧云天公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

晶狀體分離及培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫臼處死，無(wú)菌操作取雙側(cè)眼球，生理鹽水、青霉素（80萬(wàn) U/500 mL）及慶大霉素（8萬(wàn) U/500 mL）沖洗數(shù)分鐘后，在手術(shù)顯微鏡下用晶狀體圈匙游離晶狀體組織，置入含有1.5mLM199的24孔培養(yǎng)板中，每孔1只晶狀體。

分組處理 隨機(jī)數(shù)字法將晶狀體分為4組，每組20只。空白對(duì)照組：?jiǎn)渭僊199培養(yǎng)基1.5 mL+青霉素及鏈霉素各300 U；五味子乙素組：空白對(duì)照組培養(yǎng)液1.35 mL+5 mmol/L五味子乙素0.15 mL；氧化損傷組：空白對(duì)照組培養(yǎng)液1.35 mL+1 mmol/L H2O20.15 mL；氧化損傷+五味子乙素組：氧化損傷組培養(yǎng)液1.35 mL+5 mmol/L五味子乙素0.15 mL。分別在晶狀體培養(yǎng)后6 h、12 h及24 h觀察晶狀體混濁程度并拍照。

晶狀體透明度觀察記錄方法在白色背景下設(shè)計(jì)粗細(xì)一致的十字交叉黑色線條，所檢查的晶狀體放置在十字交叉處，根據(jù)透過(guò)晶狀體所能看到的線條清晰度進(jìn)行分級(jí)：“-”：晶狀體透明，線條清晰可見(jiàn)；“+”：線條增粗，模糊，但是完全可見(jiàn)；“++”：只有晶狀體中央部可見(jiàn)線條輪廓。

透射電子顯微鏡觀察晶狀體超微結(jié)構(gòu) 培養(yǎng)24 h完成拍照后，每組隨機(jī)取10只晶狀體，手術(shù)顯微鏡下小心撕取晶狀體前囊膜，晶狀體組織固定于2.5%戊二醛溶液中，4℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗后1%四氧化鋨后固定，梯度脫水后包埋劑包埋，做超薄切片，檸檬酸鉛和醋酸鈾染色5 min。

Western blot檢測(cè)HO-1及Nrf-2的蛋白表達(dá)量完成前述晶狀體前囊膜取材后，研磨剩余的晶狀體組織，RIPA裂解液提取總蛋白后，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度，電泳分離蛋白及轉(zhuǎn)膜后分別加入一抗、二抗，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法曝光顯影并掃描灰度，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）為內(nèi)參，比較各組HO-1及Nrf-2的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。晶狀體混濁程度組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。HO-1及Nrf-2相對(duì)表達(dá)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 晶狀體透明度

整體上，各組晶狀體透明度均有隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降的趨勢(shì)。同一時(shí)間點(diǎn)比較，空白對(duì)照組及五味子乙素組差異較小（P＞0.05），培養(yǎng) 6 h、12 h 后以“-”晶狀體為主，培養(yǎng)24 h后以“-”“+”為主；氧化損傷+五味子乙素組3個(gè)時(shí)點(diǎn)的“-”晶狀體比例均低于空白對(duì)照組及五味子乙素組，但組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；氧化損傷組各時(shí)點(diǎn)“+”“++”晶狀體比例高于其他各組，其中與空白對(duì)照組及五味子乙素組的差異最明顯（P＜0.05）（表 1）。

圖1為培養(yǎng)24 h后，各組典型樣本的檢查圖片。空白對(duì)照組及五味子乙素組晶狀體透明，可以清晰看到晶狀體下方的十字線，氧化損傷組晶狀體透明度明顯降低，晶狀體下方的十字線增粗、模糊，僅晶狀體中央部隱約可見(jiàn)線條輪廓，而氧化損傷+五味子乙素組晶狀體混濁情況明顯輕于氧化損傷組。

2.2 晶狀體超微結(jié)構(gòu)

培養(yǎng)后24 h后，透射電子顯微鏡觀察晶狀體內(nèi)超微結(jié)構(gòu)改變。空白對(duì)照組及五味子乙素組晶狀體上皮細(xì)胞胞膜完整連續(xù)，核仁形態(tài)規(guī)則，呈圓形或橢圓形；氧化損傷組晶狀體上皮細(xì)胞呈彌漫性改變，胞膜殘缺不全，胞質(zhì)內(nèi)線粒體空泡變性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、裂解，細(xì)胞核體積縮小，部分核碎裂；氧化損傷+五味子乙素組多數(shù)晶狀體上皮細(xì)胞形態(tài)改變輕微，染色質(zhì)凝聚或成塊，可看到連續(xù)的核膜結(jié)構(gòu)（圖2）。

表1 各組SD大鼠晶狀體離體培養(yǎng)不同時(shí)間后透明度分級(jí)比較（眼只數(shù)）

圖1 各組SD大鼠晶狀體離體培養(yǎng)24 h后透明度比較。以在白色背景下黑色十字交叉線條評(píng)價(jià)透明度，1A.空白對(duì)照組，1B.五味子乙素組，晶狀體透明；1C.氧化損傷組，十字線增粗、模糊，僅晶狀體中央部隱約可見(jiàn)線條輪廓；1D.氧化損傷+五味子乙素組，晶狀體混濁情況明顯輕于氧化損傷組

圖2 各組SD大鼠晶狀體離體培養(yǎng)24 h后晶狀體組織透射電鏡像（×500）。2A.空白對(duì)照組，晶狀體上皮細(xì)胞胞膜完整連續(xù)，核仁形態(tài)規(guī)則，呈圓形或橢圓形；2B.五味子乙素組，晶狀體上皮細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯改變；2C.氧化損傷組，晶狀體上皮細(xì)胞呈彌漫性改變，胞膜殘缺不全，胞質(zhì)內(nèi)線粒體空泡變性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、裂解，細(xì)胞核體積縮小，部分核碎裂；2D.氧化損傷+五味子乙素組，多數(shù)晶狀體上皮細(xì)胞形態(tài)改變輕微，染色質(zhì)凝聚或成塊，可看到連續(xù)的核膜結(jié)構(gòu)

2.3 晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)HO-1及Nrf-2表達(dá)

氧化損傷組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞中HO-1及Nrf-2的蛋白表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組及五味子乙素組（P＜0.05）；氧化損傷+五味子乙素組大鼠晶狀體中HO-1及Nrf-2的蛋白表達(dá)量較空白對(duì)照組及五味子乙素組降低（P＞0.05），但高于氧化損傷組（P＜0.05）（表2）。可見(jiàn)，五味子乙素能使受氧化損傷晶狀體上皮細(xì)胞的抗氧化酶HO-1及Nrf-2的蛋白表達(dá)增加，提示五味子乙素對(duì)H2O2引起的晶狀體氧化損傷有一定的保護(hù)作用。胞自身抗氧化防御系統(tǒng)、延緩白內(nèi)障的發(fā)生是一個(gè)合理的防治策略[7-8]。

五味子乙素是一種從五味子果實(shí)中提取的有效單體，有很強(qiáng)的抗氧化作用，能維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整，減少活性氧生成，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，在臨床上廣泛用于心腦血管病的治療[9-10]。近年來(lái)，已有學(xué)者將五味子乙素引入到眼科疾病治療中[11]。本課題旨在研究五味子乙素對(duì)大鼠晶狀體上皮細(xì)胞的作用，明確五味子乙素是否能改變晶狀體上皮細(xì)胞中HO-1、Nrf-2的表達(dá)，抑制氧自由基導(dǎo)致

圖3 Western Blot法檢測(cè)各組SD大鼠離體培養(yǎng)晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)HO-1及Nrf-2蛋白表達(dá)的電泳圖 HO-1:血紅素加氧酶-1 Nrf-2:核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2 GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶

表2 各組SD大鼠離體培養(yǎng)晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)HO-1及Nrf-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

表2 各組SD大鼠離體培養(yǎng)晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)HO-1及Nrf-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：HO-1及Nrf-2測(cè)定以GAPDH為內(nèi)參。單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與五味子乙素組比較，bP＜0.05；與氧化損傷組比較，cP＜0.05 HO-1:血紅素加氧酶-1 Nrf-2:核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2 GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶

0.99±0.07 1.08±0.09 0.42±0.11ab 0.82±0.18c F值P值組別 樣本量 HO-1 Nrf-2空白對(duì)照組五味子乙素組氧化損傷組氧化損傷+五味子乙素組10 10 10 10 1.02±0.17 1.14±0.16 0.33±0.14ab 0.78±0.13c 69.87 0.013 63.76 0.006

3 討論

多項(xiàng)研究證實(shí)，氧化應(yīng)激是白內(nèi)障發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。通常情況下，自由基的生成與氧代謝之間處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦這種平衡破壞，過(guò)量產(chǎn)生的自由基便會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[4-5]。大量的氧代謝產(chǎn)物導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)或DNA氧化損傷，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生直接毒性作用[6]。

雖然手術(shù)可以治愈白內(nèi)障，但是，由于醫(yī)療資源分布不均衡，很多地區(qū)缺乏必要的手術(shù)器械，一些地方醫(yī)院面臨手術(shù)醫(yī)生短缺的問(wèn)題，難以滿足大量患者的醫(yī)療需求。因此，有必要開(kāi)發(fā)延緩白內(nèi)障發(fā)展的藥物。使用抗氧化劑和某些代謝受體激動(dòng)劑加強(qiáng)細(xì)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，從而進(jìn)一步拓寬五味子乙素的臨床應(yīng)用領(lǐng)域。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者嘗試了大量方法，模擬白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)理誘導(dǎo)晶狀體組織凋亡，如化學(xué)藥物、紫外線照射、H2O2等[12-13]。本實(shí)驗(yàn)中，我們參考既往學(xué)者制備過(guò)氧化氫誘導(dǎo)鼠白內(nèi)障方法，建立大鼠白內(nèi)障模型[14-15]，觀查五味子乙素對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的保護(hù)作用。觀察結(jié)果顯示，氧化損傷組晶狀體透明度明顯下降，氧化損傷+五味子乙素組的透明度好于氧化損傷組，提示五味子乙素的干預(yù)對(duì)維持晶狀體的透明度有保護(hù)作用。透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，五味子乙素可以改善晶狀體上皮細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)一步證實(shí)了藥物對(duì)白內(nèi)障發(fā)生的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)中，我們采用1 mmol/L H2O2作為誘發(fā)因素引起晶狀體氧化損傷，H2O2可引起大量自由基的產(chǎn)生，導(dǎo)致晶狀體內(nèi)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，抗氧化平衡機(jī)制受到破壞，我們同時(shí)測(cè)定了HO-1以及Nrf-2的蛋白含量。HO-1是細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的一種抗氧化酶，幾乎分布于所有的組織和器官，Nrf-2是已知的HO-1的上游調(diào)控因子，Nrf-2在體內(nèi)可被氧化應(yīng)激及其他反應(yīng)組分廣泛激活，對(duì)機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。結(jié)果顯示，五味子乙素能使受氧化損傷晶狀體的抗氧化酶HO-1及Nrf-2的表達(dá)增加，提示五味子乙素對(duì)H2O2引起的晶狀體氧化損傷有一定的保護(hù)作用。

由此可見(jiàn)，五味子乙素對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷具有抑制化作用，其作用機(jī)制可能與上調(diào)HO-1及Nrf-2的表達(dá)有關(guān)。五味子乙素作為一種單體類藥物，其細(xì)胞毒性未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，鑒于其臨床應(yīng)用的有效性及安全性，我們認(rèn)為，五味子乙素有望成為治療白內(nèi)障的有效藥物。