益精杞菊地黃顆粒對慢性高眼壓大鼠視網膜神經節細胞凋亡的影響

張兆康 ，倘孟瑩 ，滕月 ，張麗霞

青光眼（glaucoma）是一種眼科常見疾病，其發病迅速、危害性大且不可逆轉，且具有隱匿性、遺傳性等特點，是導致人類失明的三大致盲眼病之一［1］。它是以視神經結構、視功能狀態改變及視網膜神經纖維缺損為特征的視神經退行性疾病。根據世界各地流行病研究［2］，到2020年和2040年全球青光眼人數將分別達到7960萬和1.118億。青光眼視神經保護藥物種類不少，新的藥物也不斷推出，但療效都存在一定局限性［3］。本項目通過燒灼鞏膜上靜脈法建立持續性高眼壓動物模型,評價益精杞菊地黃顆粒對慢性高眼壓大鼠視網膜神經節細胞（Retinal ganglion cells，RGCs）凋亡的影響，為該中藥臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠7～8 w齡 60只,體重約180～220g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。“益精杞菊地黃顆粒”由枸杞子配方顆粒、菊花配方顆粒、熟地黃配方顆粒、山萸肉配方顆粒、澤瀉配方顆粒、茯苓配方顆粒、黃芪配方顆粒等組成，由中國中醫科學院眼科醫院藥劑科提供，加適量水溶解，無菌密封后放入4℃冰箱保存。

1.2 分組及模型建立

1.2.1 實驗分組及給藥 將“益精杞菊地黃顆粒”臨床成人劑量（mg/kg）的 5倍、10倍、20倍，分別定為高劑量中藥組、中劑量中藥組、低劑量中藥組，每組大鼠各12只，高、中、低劑量中藥組分別給予不同濃度的顆粒劑灌胃給藥。模型組與對照組給予等量的生理鹽水灌胃。

1.2.2 高眼壓動物模型的建立 根據燒灼鞏膜上靜脈法制成慢性高眼壓模型［4］。術前左氧氟沙星眼藥水沖洗眼部（右眼）消毒，于上瞼中點做牽引縫線以拉開眼瞼。在顯微鏡下，沿角膜緣外2 mm處行放射狀的切口剪開外側及上方球結膜，仔細分離筋膜和肌肉，可發現暴露鼻上、顳上和顳下象限2或3條鞏膜上靜脈，用眼科手術止血器燒灼這3支鞏膜上靜脈，烙閉成功的標志即燒灼處靜脈血流消失，近端靜脈充血怒張。術后用生理鹽水沖洗結膜囊，平復球結膜，復方妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。大鼠的平均眼壓在22 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)以上者則為造模成功。

1.2.3 取材及標本制備灌胃給藥4 w后進行取材，將大鼠過量麻醉處死，快速摘取右眼眼球，留取部分球后視神經組織，4%多聚甲醛（4℃）中固定24 h，石蠟包埋備HE染色、Tunel實驗用。

1.3 檢測方法

1.3.1 眼壓測量 用Tono-pen AVIA筆式眼壓計測量眼壓。測量時予鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉，眼壓計輕觸角膜10次，自動讀取眼壓值（去除變異系數＞5%的數值）。每次測量眼壓均在上午10點左右，由同一人進行完成，每次每只眼測量3次，取平均值。分別于造模前、造模后即刻及造模后每周測量1次,共1個月。

1.3.2 HE染色 石蠟切片常規脫臘至水化；采取蘇木素-伊紅染色，經75%乙醇1×10 s，85%乙醇Ⅱ1×10 s，95%乙醇Ⅰ1×30 s、乙醇Ⅱ1×30 s，100%乙醇Ⅰ1×3 min、100%乙醇Ⅱ1×3 min、100%乙醇Ⅲ1×3 min，二甲苯Ⅰ1×3 min、二甲苯Ⅱ1×3 min、二甲苯Ⅲ1×3 min進行脫水透明。中性樹膠封片，風干,光鏡下觀察各組大鼠視網膜的形態結構及大鼠RGCs層細胞數量。

1.3.3 TUNEL檢測 石蠟切片常規脫臘至水化;0.25%Triton X-100檸檬酸鈉溶液（0.1%）4℃反應30 min；制備TUNEL反應混合液，處理組用TdT50 μl+熒光素標記的dUTP液450 μl混勻；而陰性對照組僅加50 μl熒光素標記的dUTP液；玻片干后，處理組滴加TUNEL反應混合液50 μl，陰性對照組滴加dUTP 液 50 μl，置 37℃濕盒中 1 h；滴加 DAPI300 μl于標本上，室溫下5 min；玻片干后，用抗熒光衰減封片劑封片，風干，熒光顯微鏡下觀察并拍照。觀察各組大鼠RGCs的凋亡情況，計算出大鼠RGCs層的凋亡陽性細胞率。

1.4 統計學分析

所有數據采用SPSS17.0軟件包進行統計學分析，定量指標以均數±標準差（）表示。多組間的比較用完全隨機設計的單因素方差分析（One-way ANOVA）。兩組間的多重比較，采用LSD-t檢驗，各組與對照組或模型組的比較，采用Dunnett t(2-sided)。自身的前后對照比較用配對t檢驗（Paired-samples T Test）,當 P＜0.05，則認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 眼壓測量結果

造模前大鼠眼壓平均為 （12.90±1.23）mm Hg，各組大鼠眼壓比較無統計學意義（P＞0.05）。造模后用藥前，模型組及高、中、低劑量中藥組的大鼠眼壓明顯升高，與造模前比較有統計學意義(P＜0.01)，與空白組比較，有統計學意義（P＜0.01)，說明造模成功；而模型組與各用藥組大鼠眼壓比較，無統計學意義（P＞0.05），說明各組間均衡、有可比性。用藥后1個月，模型組及高、中、低劑量中藥組與造模前比較有統計學意義（P＜0.01），與空白組比較有統計學意義（P＜0.01)；模型組及各用藥組與造模后用藥前比較，無統計學意義（P＞0.05），但各用藥組眼壓有所下降；模型組眼壓與各用藥組比較，無統計學意義（P＞0.05）；中藥各用藥組間比較，無統計學意義 （P＞0.05）。 見表1

表1 各組大鼠造模及用藥前后的眼壓比較(，n=12)(單位:mm Hg)

表1 各組大鼠造模及用藥前后的眼壓比較(，n=12)(單位:mm Hg)

注：▲與造模前比較，P＜0.01，有統計學意義。*與模型組比較，P＜0.01，有統計學意義。#與空白組比較，P＜0.01，有統計學意義。

組別 造模前 造模后用藥前 用藥后1個月空白組 13.36±1.80 13.27±1.67* 13.00±0.33*模型組 12.91±1.57 34.81±1.99▲# 32.55±1.96▲#高劑量中藥組 12.36±1.56 35.64±1.12▲# 32.91±1.75▲#中劑量中藥組 12.96±1.43 35.54±1.43▲# 33.00±1.34▲#低劑量中藥組 13.55±1.44 34.98±1.53▲# 32.04±1.41▲#

2.2 HE染色觀察各組大鼠視網膜的病理變化

2.2.1 大鼠視網膜形態結構 空白組視網膜組織結構完整，各層次分明、排列整齊，視網膜神經節細胞（RGCs）單層排列，形態規則，內、外核層排列整齊，無異常。模型組大鼠視網膜結構不完整，RGCs數量明顯減少、排列十分紊亂、形態不規則，部分細胞胞核裂解、變性，內、外核層排列疏松。中劑量中藥組大鼠視網膜各層次基本分明，RGCs排列較整齊，形態較規則，數量無明顯減少，內外核層排列稍紊亂。高、低劑量中藥組大鼠視網膜組織結構破壞，RGCs數量減少、排列較紊亂，內外核層排列較疏松。見圖1

2.2.2 大鼠RGCs層細胞數量 模型組RGCs層細胞數量較空白組顯著減少（P＜0.01），差異有統計學意義。與模型組相比，高、中劑量中藥組RGCs層細胞數量較多（P＜0.01），差異有統計學意義；低劑量中藥組與模型組相比，無統計學意義（P＞0.05）。見表2

2.3 Tunel檢測各組大鼠RGCs凋亡結果

干預1個月后，空白組大鼠RGCs層中未見細胞凋亡，模型組大鼠RGCs層中TUNEL陽性細胞明顯表達，內、外核層存在細胞凋亡，中劑量中藥組大鼠RGCs層中TUNEL陽性細胞少量表達，低、高劑量中藥組表達較多。見圖2

各組大鼠RGCs中凋亡率分別為空白組（4.32±4.05）%、 模型組 （31.49±2.27）%、 高劑量中藥組（26.64±2.51）%、中劑量中藥組（12.91±1.44）%、低劑量中藥組（27.43±22.51）%。空白組與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)；中劑量中藥組較模型組，差異有統計學意義(P＜0.01)；高、低劑量中藥組較空白組，差異有統計學意義(P＜0.01)，較模型組差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2

表2 各組大鼠RGCs層細胞計數及視網膜神經節細胞凋亡率比較（，n=12）

表2 各組大鼠RGCs層細胞計數及視網膜神經節細胞凋亡率比較（，n=12）

注：* 與模型組比較，P＜0.01；# 與空白組比較，P＜0.01

組別 RGCs層細胞計數 凋亡率（%）空白組 17.33±1.79* 4.32±4.05*模型組 9.37±1.71 31.49±2.27#高劑量中藥組 13.30±1.41* 26.64±2.51#中劑量中藥組 15.32±1.46* 12.91±1.44*#低劑量中藥組 10.52±1.31 27.43±22.51#F 122.52 120.98 P＜0.001 ＜0.001

圖1 光學顯微鏡下各組大鼠的視網膜結構（400× HE）1A 空白組；1B 模型組；1C高劑量組；1D中劑量組；1E低劑量組

圖2 熒光顯微鏡下各組大鼠視網膜節細胞的凋亡 （200×TUNEL）2A 空白組；2B 模型組；2C高劑量中藥組；2D中劑量中藥組；2E低劑量中藥組。白箭頭指凋亡細胞

3 討論

3.1 動物模型的制備與思考

青光眼的動物模型大多是通過升高眼壓而達到實驗模擬青光眼視神經損害的目的。青光眼造模方法很多，且在不同時期曾廣泛應用，但各有利弊。目前常用的慢性高眼壓模型建立方法主要有前房注射法、激光光凝鞏膜上靜脈法、高滲鹽水注射鞏膜上靜脈法、鞏膜上靜脈燒灼法等[5-7]。

本實驗選擇燒灼大鼠鞏膜上靜脈法造模，烙閉SD大鼠的右眼鼻上、顳上和顳下象限3條鞏膜上靜脈，使房水外流阻力增加。近幾年，這種方法被廣泛用于動物實驗研究中。本實驗結果發現術后即刻眼壓明顯升高，在造模后1個月眼壓穩定，保持在高眼壓水平，同時病理及細胞凋亡檢測結果顯示，隨著高眼壓損傷時間持續，RGCs結構呈進行性損害，RGCs層細胞數量不斷遞減，RGCs層凋亡率顯著增加，與國內外研究一致[4,8]。因此，該實驗慢性高眼壓模型建立是成功的。綜合國內外文獻，該模型方法較成熟，優勢在于簡單、易于操作、重復性強、成本較低，眼壓升高維持時間較長且穩定，并能造成視神經損害，類似于人類青光眼發病過程，有利于青光眼的視神經保護的進一步研究。

3.2 益精杞菊地黃顆粒對視網膜神經節細胞凋亡的保護作用

本實驗通過病理學及細胞凋亡檢測表明益精杞菊地黃顆粒對慢性高眼壓大鼠RGCs有保護作用。從組織病理學可以看出模型組大鼠視網膜結構不完整，RGCs排列十分紊亂、形態不規則，部分細胞胞核被破壞，內、外核層排列疏松，RGCs層的細胞數量較空白組顯著減少（P＜0.01）。中藥中劑量組經治療后，視網膜各層次基本分明，RGCs形態較規則，排列較整齊，內、外核層排列稍紊亂，RGCs層的細胞數量比模型組多（P＜0.01），差異有統計學意義。中藥高、低劑量組類似于模組型的病理變化。從Tunel檢測結果顯示，模型組大鼠RGCs層中TUNEL陽性細胞明顯表達，內、外核層存在細胞凋亡。中藥中劑量組TUNEL陽性細胞少量表達，較模型組有統計學意義(P＜0.01)。以上研究結果說明中劑量的益精杞菊地黃顆粒在一定程度上可減少RGCs凋亡，對青光眼神經節細胞有保護作用。

高健生研究員在長期的臨床基礎上總結出 “益精升陰斂聚法”[9]，并創立了青光眼視神經保護的有效經驗方“益精杞菊地黃顆粒”[10]。他認為青光眼是因玄府閉塞，氣血津液不行而引發的目系眼病。“玄府閉塞、精血不足、髓海失養”應是青光眼視神經損害的主要病機，故以“疏通玄府、補益肝腎”作為青光眼視神經保護的首要治則。

益精杞菊地黃顆粒劑是根據以上思想，在經典方杞菊地黃丸基礎上化裁而成，去山藥，加葛根、生黃芪等。方中六味地黃丸可滋補肝腎精血，熟地黃，甘微溫，歸肝腎經，補血養陰、填精益髓；菊花，苦辛微寒，清熱解毒，清疏上焦頭目風熱，有助于升發陰精；枸杞子，甘平，歸肝腎經，滋補肝腎、益精明目。二者入肝經，具有滋陰、養肝、明目之效。既往諸醫家，其治多注重補益肝腎，而未考慮到神光即視功能的保護，不只依賴陰精，還要重視氣與陽的作用，所以在補陰藥基礎上輔以補陽藥物。生黃芪，味甘，微溫，可補氣健脾、升陽舉陷、益衛固表、利尿消腫、托毒生肌。氣為血之帥，生黃芪大補元氣，能助血運行，升舉清揚之氣達目竅，并且取其“陽中求陰”之意，使陰精泉源不竭，上養目竅。補益肝腎之品多質重滋膩，入下焦，但目竅精微，其位高，所以常加入升運精血之升陰藥物。葛根，甘、辛，涼，能解肌透疹、生津止渴、升陽止瀉，本方取其升發之意，有升發陰精之效。全方合用，共奏滋補肝腎、益精養血明目之功，保護青光眼患者的視功能。現代藥理研究，葛根素[11]能擴血管，改善高眼壓視神經軸漿流及視盤微循環，防治視網膜損傷。茯苓、澤瀉可緩解房水的瘀閉狀態，降低眼壓。以上諸藥相配充分發揮滋補肝腎、益精養血明目的作用，以保護青光眼患者的視功能。

3.3 展望

中藥在青光眼視神經保護方面有具有廣闊前景和潛力，高健生研究員創立的 “益精杞菊地黃顆粒劑”雖主治目疾，但是從整體觀念角度調節全身的臟腑經絡、氣血津液，體現了中醫的“治病求本”治療原則[12]。本課題從病理學、細胞凋亡等方面觀察了益精杞菊地黃顆粒對慢性高眼壓大鼠RGCs的影響,發現其抑制、延緩RGCs凋亡的作用。

臨床上治療青光眼經驗是在 “益精杞菊地黃顆粒劑”基礎上聯合降眼壓藥物，所以后續動物實驗我們可加入益精杞菊地黃顆粒劑和降眼壓藥治療組，進行更深層的觀察研究，為臨床治療方案的研究提供理論基礎。還可進行拆方處理，探討方中起主要作用的藥物。