芍藥苷對糖尿病大鼠視網膜Müller細胞的保護作用

張博，李鳳君，左中夫

糖尿病視網膜病變 (diabetic retinopathy，DR)人群不斷增加，晚期易導致失明，對患者的生活帶來沉重的負擔[1]。近年來研究證實神經退行性變亦是DR的重要發病機制，且早于微血管病變[2]。因此，有效預防和治療DR神經病變亦尤為重要。中醫中藥在防治糖尿病中扮演重要的角色[3]。芍藥苷為芍藥的主要成分,被證實具有降低血糖及神經保護等作用[4]，近期研究發現，芍藥苷可通過HSP70/TLR4/NF-κB通路抑制小膠質細胞基質金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase-9，MMP-9）活化，從而改善 DR[5]，但對Müller細胞的影響還未見報道。因此，本研究通過芍藥苷對糖尿病大鼠灌胃治療，探討芍藥苷對糖尿病大鼠視網膜Müller細胞的影響，期望為DR治療策略的探討提供更全面的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物分組及模型制備 SPF級雄性SD大鼠40只，體質量 220～240 g(購自錦州醫科大學，編號：SCXK(遼)2014-16)。動物飼養室溫25℃，濕度43%，自由攝食飲水。將動物隨機分成對照組、糖尿病組、芍藥苷組及二甲雙胍組，每組各10只。后3組大鼠采用單次腹腔注射STZ (50 mg·kg-1)，72 h后檢測尾靜脈血糖，將血糖濃度＞16.7 mmol·L-1的大鼠作為糖尿病模型。模型誘導成功后，依據文獻，芍藥苷組給予芍藥苷(20 mg·kg-1)灌胃治療[6]，每日2次。二甲雙胍組給予二甲雙胍(20 mg·kg-1)作為陽性對照[7]，溶于2 ml生理鹽水灌胃治療，每日1次。對照組、糖尿病組給予等劑量生理鹽水。實驗期間動態監測大鼠血糖、體重變化。12 w后，進行各項指標檢測，實驗遵循國家《實驗動物管理條例》。

1.1.2 試劑及儀器 鹽酸二甲雙胍、鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(美國 Sigma公司)；芍藥苷(98.78%，南京格倫生物科技有限公司)；神經膠質酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、膠質細胞谷氨酸轉運體(Glial glutamate transporter,GLAST)、谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)抗體(英國Abcam公司)；谷氨酸含量檢測試劑盒、熒光二抗及Western blot二抗(北京碧云天生物公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；冰凍切片機(德國SLEE公司)；水平電泳儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本制備 12 w后，每組取4只大鼠，水合氯醛麻醉后經心臟灌注4%多聚甲醛固定。固定完成后將大鼠眼球取出于固定液中，4℃保存，用于免疫熒光。每組取6只大鼠水合氯醛深度麻醉，取新鮮視網膜(左眼)于2.5 ml EP管中，依據重量加蛋白裂解液，冰上剪碎，4℃離心機25 min后取上清，-20℃保存用于Western blot；右眼視網膜稱重勻漿后加無水乙醇1 mL，離心20 min后取上清-20℃保存用于視網膜谷氨酸含量檢測。

1.2.2 視網膜谷氨酸含量檢測 視網膜谷氨酸含量檢測應用可見分光光度法，操作嚴格按照說明書進行，按照蛋白濃度計算處視網膜谷氨酸濃度。

1.2.3 免疫熒光檢測大鼠視網膜GFAP、GLAST表達 將固定液中的眼球取出后用20%蔗糖溶液脫水，OCT包埋后切片，厚度為12 μm。載玻片于PBS洗滌3次，每次5 min；5%山羊血清+0.1%Triton-100室溫孵育30 min；不洗，滴加兔抗大鼠GFAP(1:700)、兔抗大鼠 GLAST(1:600)，4℃過夜；PBS 洗滌 3次，每次5 min；滴加山羊抗兔二抗，室溫避光2 h；PBS洗滌3次，每次5 min；封片后熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 Western blot檢查大鼠視網膜GFAP、GLAST、GS相對表達量：BCA法測定蛋白濃度，確定電泳時加入15 μL樣品；開始電泳，調整電壓為90 V，待電泳條帶成一條直線時，調整電壓為120 V；半干轉轉膜膜后取目的條帶，1%BSA室溫封閉2 h；加入一抗(兔抗大鼠GFAP，1:10000；兔抗大鼠GLAST，1:8000；兔抗大鼠 GS，1:8000)，4℃孵育過夜；TBST 洗滌4次，每次5 min；加入HRP標記的二抗室溫2 h，孵育后TBST洗滌4次，每次5 min；ECL試劑盒顯影，Image J軟件分析灰度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件分析，所有數值以均數±標準差()表示，計量數據進行單因素方差分析及LSD檢驗，P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 造模前后血糖體重變化

大鼠造模前，4組體重之間比較 (F=0.59，P>0.05)，血糖之間比較(F=1.38，P>0.05)，兩者均無統計學差異。造模12 w后，4組之間相比，體重(F=2.42，P＜0.01)、血糖(F=26.63，P＜0.01)，均具有統計學意義。與對照組相比，糖尿病組、芍藥苷組及二甲雙胍組大鼠體重明顯降低，比較有統計學差異(P＜0.01)，而3組之間比較，無統計學差異(P>0.05)。

與對照組相比，糖尿病組血糖均>16.7mmol·L-1，與糖尿病組比較，芍藥苷組血糖有所下降但仍高于正常，差異有統計學意義(P＜0.01)，二甲雙胍組與對照組之間未見明顯差異(P>0.05)。見表1、圖1

表1 各組大鼠血糖(mmol·L-1)、體重(g)(，n=10)

表1 各組大鼠血糖(mmol·L-1)、體重(g)(，n=10)

注：*與對照組相比，P＜0.01

組別 血糖 體重造模前 造模前 造模后3個月對照組 4.31±0.12 224.01±13.14 415.45±14.64糖尿病組 4.45±0.64 235.15±12.51 246.81±13.59*芍藥苷組 4.33±0.39 236.52±16.32 251.42±13.49*二甲雙胍組 4.43±0.27 226.72±15.36 249.22±12.04*造模后3個月4.43±0.67 18.25±1.45*8.52±1.29*4.42±0.38

2.1 視網膜谷氨酸含量檢測

4組之間視網膜谷氨酸含量比較，有統計學差異(F=720.05，P＜0.01)。同對照組比較，糖尿病組谷氨酸含量明顯升高(P＜0.01)。同糖尿病組比較，芍藥苷組及二甲雙胍組谷氨酸含量明顯下降(P＜0.01)。見表2

表2 各組大鼠視網膜谷氨酸含量(，n=6)及免疫熒光檢測各蛋白表達 (，n=4)

表2 各組大鼠視網膜谷氨酸含量(，n=6)及免疫熒光檢測各蛋白表達 (，n=4)

注：*與對照組相比，P＜0.01；#與糖尿病組相比，P＜0.01

組別 谷氨酸含量(μmol/g)GFAP熒光強度(%)GLAST熒光強度(%)對照組 23.71±0.94 100.00±0.00 100.00±0.00糖尿病組 43.53±0.86* 175.54±2.47* 68.48±1.26*芍藥苷組 31.56±0.93# 146.37±1.4# 81.53±2.47#二甲雙胍組 32.38±0.72# 99.52±1.55# 98.72±0.98#

2.2 免疫熒光檢測結果

GFAP在對照組主要微量表達于視網膜節細胞層，將對照組GFAP蛋白免疫熒光強度設定為100.00%，熒光強度分析結果，4組之間比較，有統計學意義(F=3226.47，P＜0.01)。 同對照組比較，糖尿病組熒光強度明顯升高(P＜0.01)。同糖尿病組比較，芍藥苷組及二甲雙胍組熒光強度均不同程度下降且二甲雙胍組下降更明顯(P＜0.01)。見表2、圖1

GLAST在視網膜各層均有表達，將對照組GLAST蛋白免疫熒光強度設定為100.00%，熒光強度分析結果：4組之間比較，有統計學意義 (F=587.19，P＜0.01)。 同對照組相比，糖尿病組 GLAST 熒光強度明顯下降(P＜0.01)，同糖尿病組比較，芍藥苷組及二甲雙胍組熒光強度明顯升高且二甲雙胍組升高更明顯(P＜0.01)。 見表 2、圖 1

2.3 Western bolt檢測 GFAP、GLAST、GS 蛋白相對表達量

GFAP蛋白相對表達量：4組之間比較，有統計學意義(F=423.02，P＜0.01)。同對照組比較，糖尿病組GFAP表達明顯增加(P＜0.01)，同糖尿病組比較，芍藥苷組及二甲雙胍組GFAP均顯下降(P＜0.01)。見表3、圖2

GLAST蛋白相對表達量：4組之間比較，有統計學意義(F=129.56,P＜0.01)。同對照組比較，糖尿病組GLAST表達明顯減少(P＜0.01)，而同糖尿病組比較，芍藥苷組及二甲雙胍組GLAST表達明顯增加(P＜0.01)。 見表 3、圖 2

GS蛋白相對表達量：4組之間比較，有統計學意義(F=2.84,P＜0.01)。同對照組比較，糖尿病組GS表達明顯減少(P＜0.01)，而同糖尿病組比較，芍藥苷組與二甲雙胍組GS表達明顯增加(P＜0.01)。見表3、圖2

表3 各組大鼠視網膜蛋白相對表達量(，n=6)

表3 各組大鼠視網膜蛋白相對表達量(，n=6)

注：*與對照組相比，P＜0.01；#與糖尿病組相比，P＜ 0.01

組別 GFAP(%) GLAST(%) GS(%)對照組 8.60±0.59 17.81±1.17 35.94±1.04糖尿病組 22.85±1.02* 8.91±0.62* 22.94±0.64*芍藥苷組 16.28±0.88# 12.67±1.01# 30.07±1.40#二甲雙胍組 8.74±0.63# 16.92±0.75# 34.03±0.88#

圖1 免疫熒光檢測各組大鼠視網膜GFAP(紅色)、GLAST(綠色)的表達(箭頭示陽性表達，×200)。對照組：GFAP主要微量表達于節細胞層，GLAST在視網膜各層均有表達；糖尿病組：GFAP表達明顯增強，貫穿于視網膜全層，而GLAST表達較對照組明顯減少；芍藥苷組：與糖尿病組相比，GFAP表達有所減少，但仍高于對照組，而GLAST表達高于糖尿病組但低于對照組。二甲雙胍組：與對照組相比，GFAP與GLAST表達無明顯差別。 GCL:節細胞層；IPL:內叢狀層；INL:內核層；OPL:外叢狀層；ONL:外核層

圖2 Western blot檢測GFAP、GLAST、GS蛋白相對表達量。A對照組；B糖尿病組；C芍藥苷組；D二甲雙胍組

3 討論

近年研究顯示DR發病率逐年攀升，已經成為發達國家成年人視力失明最主要的原因[8-9]。DR在我國的發病率也極高，最新發布的《中國2型糖尿病防治指南》就明確指出，DR在我國已經成為成年人致盲的首要因素。DR的高致盲率增加了患者心理及生理負擔。神經病變為微血管病變之外參與DR的重要原因。因此，有效預防和治療DR神經病變亦尤為重要。

中醫中藥在防治糖尿病中扮演重要的角色[3]。芍藥苷為芍藥的主要成分,具有降低血糖及神經保護等作用[4]，本研究證實芍藥苷可以降低糖尿病大鼠的血糖，但效果低于二甲雙胍。近期研究發現，芍藥苷可通過HSP70/TLR4/NF-κB信號通路抑制小膠質細胞MMP-9激活，從而改善DR[5]，但對Müller細胞的影響還未見報道。Müller細胞占視網膜膠質細胞的90%左右，在視網膜貫穿全層。Müller細胞具有支持及營養神經元的作用，Müller細胞結構和功能異常與DR發病關系密切[10]。GFAP是膠質細胞特有的標志性蛋白，特異性表達于膠質細胞，但Müller細胞幾乎不表達GFAP，僅當Müller細胞結構和功能異常時可見GFAP表達[11]。本研究發現，正常情況下僅在視網膜的神經節細胞層中有少量的GFAP蛋白表達，但DR狀態下視網膜不僅神經節細胞層GFAP表達明顯增加，而且免疫熒光觀察到視網膜GFAP陽性染色纖維分布空間范圍廣泛，幾乎貫穿視網膜神經組織全層，其分布范圍與Müller細胞空間位置相同。而應用芍藥苷后可見糖尿病大鼠視網膜內GFAP表達明顯減少。該結果提示，芍藥苷可能通過有效抑制DR狀態下視網膜膠質細胞活化，可能對視網膜Müller細胞起到保護作用。

GLAST為Müller細胞中最主要的谷氨酸轉運體，主要表達于Müller細胞胞體和突起。GLAST可對視網膜突觸間隙內過多的谷氨酸給予清除，從而大大減少其興奮毒性。Müller細胞是視網膜中唯一能合成GS的細胞，GS是Müller細胞的功能酶，能將轉入細胞內的谷氨酸轉化為無毒谷氨酰胺[12]，從而降低谷氨酸的細胞毒性，保護視網膜[13]。糖尿病狀態下，視網膜中谷氨酸堆積，能產生神經毒性，誘發并加重DR[14]。本研究顯示，糖尿病狀態下GFAP表達顯著增加，說明大Müller細胞已受損，而GFAP表達增加時GLAST、GS表達減少，谷氨酸含量增加，在給予芍藥苷后GFAP表達減少同時GLAST、GS在Müller細胞中的表達增加，谷氨酸含量降低。該結果進一步提示，芍藥苷可能通過抑制視網膜膠質細胞活化進而改善了糖尿病大鼠視網膜Müller細胞的功能。這提示芍藥苷可能對于改善DR具有重要的意義。

綜上所述，本研究發現芍藥苷可通過抑制DR狀態下視網膜膠質細胞活化，上調視網膜GLAST、GS表達，降低視網膜谷氨酸含量，提示芍藥苷對糖尿病大鼠視網膜病Müller細胞具有保護作用。這一發現對研究DR的治療策略提供了新的方向。但因DR發病機制復雜，芍藥苷對DR的作用可能涉及眾多途徑，因此芍藥苷對糖尿病視網膜病變的影響及機制仍待深入探討。