丹酚酸B對糖尿病腎病模型大鼠腎組織中Nrf-2和HO-1的影響

明建松 ，王曉雪 ，袁玉華△

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）為糖尿病并發癥的一種，其也是引發終末期腎臟病（ESRD）的病因之一，且本病的發病率逐年上升，大約有40%的DN患者最終會發展成ESRD［1-2］。目前，DN的發病機制尚未明了，既往的研究認為其可能與腎血流動力學改變、遺傳、炎癥、糖脂代謝紊亂以及氧化應激等機制有關［3-4］。目前，對于DN，除控制血壓、血糖等對癥支持治療外，尚無治療本病的特效藥物，很多患者在進入ESRD后，只能通過腎移植或終身透析來延續生命，大大增加了患者家庭與社會的負擔，同時患者還需承擔巨大的精神壓力。因此，對于DN的防治具有顯著的社會意義。

在DN的發生過程中，氧化應激現已被認為是一重要因素，機體氧化應激的水平上升可促使炎性因子的分泌，反過來，釋放的炎性因子又會對氧化應激的水平產生影響，進而會加重本病［5-6］。近年來相關研究表明，Nrf-2/ARE通路在機體發生抗氧化應激時發揮重要作用，若對體內轉錄因子NF-E2相關因子2（Nrf-2）的表達進行適當的干預，就可阻斷氧化應激相關通路，阻止相關疾病的進展［7］。丹參屬于傳統中藥唇形科鼠尾草屬，其有除煩安神、祛瘀止痛、涼血消癰及活血等的功用［8］。丹酚酸B則是丹參提取物中的一種，具有調血脂、抗氧化、抗肝纖維化、改善腎功能及抗炎等的功用［9-12］。當前，丹酚酸B對糖尿病血管病變進行的相關研究主要是抑制內皮細胞的凋亡及調節血脂等方面，但其對抗氧化應激方面的研究鮮有報道［13］。因此，筆者建立大鼠DN模型，觀察不同劑量的丹酚酸B灌胃后，大鼠腎組織中Nrf-2和血紅素加氧酶1（HO-1）表達的變化，探討丹酚酸B對DN的抗氧化應激作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠40只，8周齡，無特定病原體（SPF）級，體質量（200±10）g，由武漢華聯科生物公司（批號：2005416）提供，動物于天津醫科大學總醫院采用標準飼料喂養，自由飲水、飲食，適應性飼養7 d后進行實驗。本研究經天津醫科大學動物護理與使用委員會批準。

1.2 主要藥品及試劑 丹酚酸B購于西安森冉有限公司（1 kg/盒，批號：2002351）；鏈脲佐菌素（STZ，純度99.9%）購于西安熱默爾生物公司（1 g/瓶，批號：18883664），使用0.1 mmol/L的枸櫞酸鈉緩沖液（pH=4.2）配制STZ工作液（配制后30 min內使用完）；實驗檢測相關血液指標（24 h尿蛋白、血糖、血肌酐、總膽固醇及三酰甘油）的試劑盒及相關抗體購于艾美捷科技有限公司；實驗所用PCR相關試劑盒購于南京一道科技有限公司。

1.3 實驗分組與模型構建 按照隨機數字表法將40只大鼠隨機分為對照組、模型組、丹酚酸B組低及高劑量組，每組10只。模型制備：使用大鼠尾靜脈注射STZ（40 mg/kg）并高糖高脂的食物喂養以構建DN模型，對照組使用相同劑量枸櫞酸鈉緩沖液進行尾靜脈注射且為正常飲食，每日注射1次，連續1周。72 h取大鼠尾靜脈血以檢測血糖，當隨機血糖＞16.7 mmol/L或空腹血糖＞7.0 mmol/L，即為糖尿病模型構建成功；1周后，檢測大鼠24 h尿蛋白，當濃度＞20 mg/24 h，即為DN模型構建成功。藥物處理：丹酚酸B低、高劑量組大鼠于造模成功后分別給予丹酚酸B 10 mg/kg、20 mg/kg灌胃，每日1次，連續6周；對照組及模型組給予等體積橄欖油灌胃。

1.4 標本收集 分組處理6周后，收集大鼠24 h尿液，檢測24 h尿蛋白，之后采用戊巴比妥鈉麻醉后處死大鼠，采集眼球血與腎組織，分離眼球血血清用以檢測血糖、血肌酐、總膽固醇及三酰甘油的含量；腎組織洗凈后分為2份，1份在液氮中速凍后，置于-70℃保存，1份置于4%多聚甲醛中固定，常規制備石蠟切片。

1.5 生化指標檢測 取大鼠24 h尿液及血清，分別檢測24 h尿蛋白及血糖、血肌酐、總膽固醇及三酰甘油的含量，操作嚴格按照試劑盒說明書。

1.6 蛋白免疫印跡（Western blot，WB）法檢測Nrf-2、HO-1蛋白表達水平 大鼠冷凍腎組織在液氮中研磨，加入1.5 mL蛋白裂解液，采用蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，BCA法測定蛋白總量。SDS-PAGE凝膠電泳后，半干法將目的蛋白轉印至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉1 h；分別加入鼠抗Nrf-2（1∶500）、HO-1（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）的多克隆抗體，4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。采用Image-Pro Plus 6.0來檢測相關蛋白的灰度值，相對灰度值=相關蛋白的灰度值/內參GAPDH灰度值。

1.7 逆轉錄PCR（RT-PCR）法檢測腎組織中Nrf-2、HO-1 mRNA表達水平 大鼠冷凍腎組織在液氮中研磨、打碎后-70℃過夜保存，隔日解凍靜置10 min，依次下列操作，加入100 μL氯仿、靜置離心、250 μL異丙醇、靜置離心棄上清、750 μL乙醇、離心棄上清吹干，加入無酶水混勻后檢測mRNA濃度。mRNA逆轉錄成cDNA后（反應條件：42℃30 min；85 ℃ 5 min）進行PCR。引物：Nrf-2上游5′-GTGCCCT?GTGCAGTTGTG-3′，下游 5′-GATAGGTCGGCGGTTCAT-3′；HO-1 上游 5′-CAGCCACCAACAGTCATCAT-3′，下游 5′-ACTCATCGCTCATCCTTCG-3′；內參 GADPH 上游 5′-CTG?GTGTTCGGCTTTCTC-3′，下 游 5′-TTGTGGTCCATCT?CATCG-3′。反應條件：94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，30個循環；72℃5 min。采用Image-Pro Plus 6.0檢測目的基因mRNA的灰度值并計算相對表達量（目的基因的灰度值/內參GAPDH灰度值）。

1.8 PAS染色觀察腎組織病理形態變化 大鼠腎組織切片進行烘片與脫蠟后。按照PAS法染色程序對切片逐步進行染色，封片后置于光學顯微鏡下，觀察腎組織發生病理改變的程度。

1.9 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組生化指標比較 與對照組比較，模型組24 h尿蛋白、血清中血糖、血肌酐、總膽固醇及三酰甘油水平顯著升高；與模型組比較，丹酚酸B低、高劑量組上述指標均明顯下降，且呈劑量依賴性。見表1。

2.2 各組腎組織中Nrf-2、HO-1蛋白及mRNA的表達情況比較 與對照組比較，模型組大鼠腎組織中Nrf-2、HO-1蛋白及mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸B低、高劑量組大鼠腎組織中Nrf-2、HO-1蛋白及mRNA表達水平顯著升高，且呈劑量依賴性。見圖1、2，表2、3。

2.3 各組PAS染色結果的比較 對照組SD大鼠腎組織未見到異常的病理改變，腎小球毛細血管正常，基膜未見增厚等現象；與對照組比較，模型組大部分視野可見到腎小球毛細血管呈現彌漫性的增厚，腎小球變肥大及基底膜出現增厚；與模型組比較，丹酚酸B低、高劑量組大鼠腎組織病理損傷程度均減輕，且呈現出劑量依賴的趨勢。見圖3。

Fig.1 Comparison of relative expression levels of related proteins between five groups圖1 各組相關蛋白相對表達量的比較

Tab.2 Comparison of relative expression levels of Nrf-2 and HO-1 proteins between five groups表2 各組相關蛋白相對表達量的比較 （±s）

Tab.2 Comparison of relative expression levels of Nrf-2 and HO-1 proteins between five groups表2 各組相關蛋白相對表達量的比較 （±s）

組別對照組模型組t n 10 10 Nrf-2/GAPDH 0.215±0.039 0.453±0.029 15.451＊HO-1/GAPDH 0.314±0.008 0.438±0.043 8.732＊組別模型組低劑量組高劑量組F n 10 10 10 Nrf-2/GAPDH 0.453±0.029 0.635±0.057a 0.863±0.037ab 229.356＊HO-1/GAPDH 0.438±0.043 0.599±0.051a 0.791±0.046ab 138.667＊

3 討論

隨著人類各種生活習慣的變化及人口的老年化，糖尿病的發病率正在逐年的上升，早在2010年相關調查結果表明，我國糖尿病的發生率已位居全球第一［14］。DN屬于糖尿病中最常見的一種并發癥，其早期以腎小球的肥大、腎小管與腎小球基底膜的增厚以及基質的聚積等病變為主，后期則會發生腎小管間質或者腎小球的纖維化病變，最為嚴重的即是導致ESRD［15］。

Tab.1 Comparison of 24-h urine protein,blood glucose,serum creatinine,total cholesterol and triglycerides between five groups表1 各組24 h尿蛋白、血糖、血肌酐、總膽固醇及三酰甘油的比較 （n=10，x±s）

Fig.2 Comparison of relative expression levels of related mRNAs between four groups圖2 各組相關mRNA相對表達量的比較

Tab.3 Comparison of relative expression levels of related mRNAs between five groups表3 各組相關mRNA相對表達量的比較 （n=10,±s）

Tab.3 Comparison of relative expression levels of related mRNAs between five groups表3 各組相關mRNA相對表達量的比較 （n=10,±s）

組別對照組模型組t模型組低劑量組高劑量組F Nrf-2/GAPDH 0.307±0.026 0.501±0.040 12.539＊0.501±0.040 0.710±0.032a 0.881±0.040ab 250.277＊HO-1/GAPDH 0.273±0.017 0.416±0.040 10.379＊0.416±0.040 0.628±0.059a 0.751±0.035ab 133.318＊

Fig.3 Comparison of PAS staining results between four groups(×40)圖3 各組PAS染色結果的比較（×40）

丹參有除煩安神、祛瘀止痛、涼血消癰及活血等功用，對免疫系統、呼吸系統以及心腦血管等都可起到一定保護的作用，已在臨床心絞痛、失眠、肝脾腫大及痛經等各種疾病得以應用［16-17］。丹酚酸B為丹參中水溶性的成分且有活性，能夠起到調血脂、抗氧化、抗肝纖維化、改善腎功能及抗炎等的功用，但其在對抗氧化應激方面鮮有研究。

在人體中氧化應激實為一種防御功能，其與機體發生的衰老以及某些疾病等之間存在一定關聯，如糖尿病、缺血再灌注損害以及認知缺失所導致的Alzheimer病等［18］。氧化應激現已被認為是引發糖尿病及其出現相關并發癥的發病機制之一［19］。Nrf-2是機體進行抗氧化應答系統中最重要的轉錄因子，其是亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家族（即為CNC）成員中的一個，在正常的狀態之下，其可在細胞質中與Keap1發生結合，而此時的Nrf-2處于無活性的狀態，且處于極易發生降解的狀態；如若機體受到了外界的一些刺激，機體氧化應激被激活，此時Nrf-2會與Keap1發生解離，進而處于活化的狀態，其發生活化后隨即進入到細胞核中，以調節其下游的相關因子，從而抑制氧化應激反應，來抵抗外界的刺激［20］。HO-1屬于Nrf-2下游的相關因子之一，其有抗炎與抗氧化的雙重功用，現已被證明在高血壓、急性肺損傷、敗血癥以及腎損傷等疾病中有一定的保護能力。本實驗的結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠腎組織中Nrf-2、HO-1的蛋白及mRNA表達量顯著升高；與模型組比較，丹酚酸B低、高劑量組大鼠腎組織中Nrf-2、HO-1的蛋白及mRNA表達量顯著升高，且呈劑量依賴性，表明丹酚酸B可上調Nrf-2、HO-1的表達量以對DN大鼠起保護功用，這與24 h尿蛋白、血糖、血肌酐、總膽固醇與三酰甘油含量以及PAS染色的結果是相符的。

綜上所述，丹酚酸B對DN大鼠有改善的功用，其可能作用的機制與上調腎組織中Nrf-2及HO-1的表達存在一定的關聯，且其保護功用呈現為劑量依賴的趨勢。但本研究尚不足以證明丹酚酸B在氧化應激中的具體作用形式，還需為此進行相關的研究以進一步的了解其機制。除此之外，丹酚酸B可否通過其他的途徑而對腎臟起到保護作用，還需深入研究。