5個樹莓品種的DNA多態性分析及其親緣關系

王 葳，劉 婷，楊靜慧，劉艷軍，張桂霞，黃晗達

（天津農學院 園藝園林學院，天津 300384）

樹莓（Rubus corchorifolius Linn.f）又名懸鉤子、覆盆子，為薔薇科懸鉤子屬的聚合漿果。樹莓果實中除含有人體所需的糖、有機酸、維生素C及礦物質外，還富含黃酮、花青素、SOD、鞣花酸和水楊酸等多種保健成分，可以提高人體免疫力和抗氧化防衰老[1-2]，即具有營養和醫藥療效的雙重價值。因此，被列為世界第三代水果[3]，具有很高的開發價值。

中國樹莓屬植物種類繁多、分布復雜。但是，研究開發較少，大多數品種處于野生狀態，遺傳背景復雜，開發出來的品種較少[4]。國外樹莓以北美的加拿大和美國研究較多，也培育出了一批優良品種。因此，了解現有樹莓品種的親緣關系對研究和利用樹莓屬植物種質資源具有十分重要的意義。

利用RAPD-PCR技術對樹莓親緣關系進行評價的方法已日趨成熟。如Graham和McNicol[5]對國外13種不同的樹莓屬植物，李媛媛等[6]對31份野生樹莓資源的親緣關系進行了RAPD 多態性分析，分類結果與通過植物學性狀等進行分類的結果基本一致[7]。因此，通過葉片細胞DNA的RAPD多態性分析可以比較好地了解不同品種間的親緣關系，進行生物品種的鑒定、系譜分析及進化關系的研究等。本研究以期對目前北方出產主要栽培的海爾特茲、凱歐、莎妮3個樹莓品種，與引進的加拿大樹莓和南方黑樹莓之間的親緣關系進行對比，以了解其習性，為生產和育種提供依據。

1 材料和方法

供試的5個樹莓品種分別為加拿大黑莓、凱歐、莎妮、海爾特茲和南方黑樹莓，于2011年栽植于天津市西青試驗園中，每品種栽植3行，每行12株。栽植株行距為1 m ×2 m。試驗地為黏壤土，pH值8.5，土壤含鹽量為0.25%，土壤肥力中等。實施常規管理。

基因組DNA的提取采用改良的CTAB法進行DNA提取[8]。

試驗所用RAPD-PCR試劑盒購買于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。體系優化包括模板濃度的優化和退火溫度的優化。經過優化后的反應體系為：總體積25 μL，RAPD引物1 μL，dNTP0.5μL，10×PCR buffer 2.5 μL，ddH2O19.5 μL，Taq 酶 0.5 μL，DNA 模板 1 μL。預變性：94 ℃，4 min；循環次數：42次（變性：94 ℃，30 s；退火：37 ℃，30 s；延伸：72 ℃，80 s）；延伸：72 ℃，10 min；終止溫度：4 ℃。

瓊脂糖凝膠電泳：電泳方法見表1。

表1 DNA樣品及其PCR產物電泳方法

RAPD條帶分析和數據處理：將電泳圖譜上同一位置的DNA條帶的有無進行統計，有帶記為“1”，無帶記為“0”，形成1、0數據矩陣，計算各條引物的擴增條帶、多態性條帶以及多態性百分率[9]。根據公式GS=2NXY/(NX+NY)計算遺傳相似系數[10]，其中NX、NY是樣本X和YPCR擴增產物的DNA條帶總數，NXY是樣本X和YPCR擴增產物的共有條帶數。用NTsys2.1軟件進行數據分析，生成聚類圖[11]。

2 結果與分析

2.1 不同樹莓品種RAPD-PCR擴增的引物篩選和多態性分析

試驗以20條10堿基引物對5個不同品種樹莓基因組DNA進行了隨機引物的多態性擴增，從中選取了7條多態性高、重復性好的引物用于本試驗，分別是B4、B8、B10、B11、B15、B17、B18。結果發現7條引物對不同品種樹莓基因組DNA進行擴增所得條帶的相對分子質量集中在120 bp～2 000 bp之間，共擴增出65條帶，其中有60條多態性條帶，多肽率達到了92.3%。平均每條引物擴增條帶數為9.29條，平均多態性條帶數為8.57條，表明多態性較好。不同引物擴增出的條帶數和多態性條帶數及多肽百分率各不相同，B11號引物擴增出的條帶數最多，為11條；其次是B15號引物，擴增出10條；再次是B4、B10、B17、B18引物，均擴增出9條；最低為B8號引物，擴增出8條，而且7對引物所產生的多態性都非常豐富，其中B8、B10、B15號引物的多態性條帶達到了100%，B17號引物的多態性條帶最低為77.8%。以上數據表明各品種樹莓在RAPD分子水平上具有豐富的多態性（圖1和表2）。

圖1 不同品種樹莓基因組DNA的擴增結果

表2 RAPD引物對各品種樹莓葉片DNA的擴增條帶統計

2.2 不同樹莓品種的聚類分析及親緣關系

UPGMA聚類分析的結果表明（圖2），試驗中5個樹莓品種的DNA在遺傳距離為0.75的位置上可以聚為3類，其中，加拿大黑莓樹莓為第一類，南方黑樹莓為第二類，其他3個品種（海爾特茲、凱歐、莎妮）樹莓為第三類。表3顯示，5個品種中凱歐和莎妮的親緣關系最近，遺傳相似系數為0.933，加拿大黑莓與凱歐、莎妮的親緣關系較遠，遺傳相似系數分別為0.600、0.533，與海爾特茲的親緣關系最遠，遺傳相似系數只有0.400。海爾特茲與凱歐和莎妮的親緣關系較近，遺傳相似系數分別為0.800、0.867，與南方黑樹莓的親緣關系較遠，遺傳相似系數為0.600；南方黑樹莓與凱歐和莎妮的親緣關系較遠，遺傳相似系數分別為為0.571、0.500。

圖2 不同品種樹莓聚類圖

表3 不同品種樹莓遺傳相似系數矩陣

2.3 不同樹莓品種的植株形態結構差異與親緣關系的比較

RAPD的分析結果為加拿大樹莓與其他品種的親緣關系最遠，其次是南方黑樹莓，其余3個品種親緣關系較近，又以凱歐和莎妮親緣關系較近，這與其植株形態結構差異大有較好的一致性。就形態特征而言，加拿大黑莓植株較為直立型，而其他4種樹莓都是匍匐型；加拿大黑莓和南方黑樹莓沒有刺，其他3種樹莓均有密度不同的刺。南方黑樹莓與莎妮和凱歐相比，其葉片較薄，普通的背腹型葉片。而莎妮和凱歐為等面葉，具有典型的旱生植物葉片的結構。另一個試驗顯示，凱歐和莎妮這2個品種形態上、解剖結構上也十分相似[12]。

3 結 論

RAPD多態性分析結果其葉片的形態特征和解剖結構的研究結果有較好的一致性。