余甘果抑菌作用及輔助乙醛降解特性的研究

張大為，張 潔，閆 佳，田永航，裴志勝

（海南熱帶海洋學院生命科學與生態學院，海南省海洋食品工程技術研究中心，海南三亞572022）

余甘果又名“油甘”“望果”“余甘子”“牛甘果”等，是大戟科葉下珠屬落葉小喬木或灌木。后味甘甜，微酸，具有保肝護肝、抗衰老、健胃消食等功能。它不僅具有很高的營養價值，而且還有藥用價值，并被載入《中華人民共和國藥典》[1]。余甘果原產于印度、印度尼西亞等國，早在2000多年前我國就有種植，并被廣泛認知。余甘果樹主要生長在福建南部、廣東、廣西、云南、臺灣等地區，其中福建南部及廣西分布較多。余甘果是一種生命力極頑強的植物，其果實可以在常溫下放置一個多月仍保持不腐爛[2]。

余甘果的營養極為豐富，果實中含有較高的維生素C、維生素B、蛋白質、果酸、脂肪酸、十幾種微量元素和十幾種氨基酸[3]等。余甘果本身具有的價值已經引起全世界人民的高度重視。余甘果在我國南方廣為流傳，據《本草綱目》中記載，“久服余甘汁，可以輕身，延年長生”。市場上也出現了各式各樣的余甘果產品，其中余甘果蜜餞最為流行，不僅口感好，而且價格也合理，具有很好的開發前景[4-6]。余甘果有較高的藥用價值，不僅具有抗衰老作用，而且有健胃消食、抗菌消炎、生津止咳、有效止瀉、減緩惡心和治療月經失調等功能。“余甘鹵”在我國民間依然是家中常備的藥品，它是以余甘果加部分甘草浸泡在鹽水中制成的，常用于治療消化不良、痛經、風寒、厭食、肚痛腹瀉和惡心嘔吐等常見的疾病[7-8]。

果酒釀造過程中，傳統的抗菌劑是SO2，研究發現SO2會對人體健康產生危害，所以找到能夠替代SO2的物質是亟待解決的問題[9-11]。大量研究表明，很多植物能夠起到很好的抗菌作用，比如黃檗、肉桂。從植物中尋找適合于果酒釀造的天然抗菌劑已經成為可能，有望替代傳統的抗菌劑[12-13]。另外，很多人在飲酒后會出現面紅、惡心等癥狀，主要原因是乙醛所帶來的影響，其傷害程度遠遠高于乙醇。研究發現，多種植物具有解酒護肝的功能，比如人參、葛根、巴西莓等。其作用機制是通過抑制胃腸吸收乙醇和加速代謝以降低機體血醇濃度[14-17]。鑒于余甘果所具有的特殊營養價值和藥用價值，本試驗著重研究余甘果對腐敗菠蘿酒中腐敗細菌的抑制作用以及其對乙醛脫氫酶作用效果的影響，為余甘果在釀酒、解酒等方面的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

余甘果，市售。

細菌培養基：稱量牛肉膏1.5 g、蛋白胨3.0 g、NaCl 1.5 g、瓊脂6.0 g，再加入清水300 mL煮沸，調節pH7.0。

試劑：乙醛（40%，分析純），購于天津市大茂化學試劑廠；乙醛脫氫酶，sigma公司；碘、碘化鉀、亞硫酸氫鈉、淀粉、草酸銨、結晶紫、番紅等試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

儀器設備：BSP-400型生化培養箱，上海新苗醫療器械有限公司；SW-CJ-2F型超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備廠；AUY-120型分析天平，日本島津公司；PB-10型pH計，北京賽多利斯儀器系統有限公司；YXQ-LS-75SII型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SZX10攝影顯微鏡，日本OLYMPUS。

1.2 試驗方法

1.2.1 腐敗菠蘿酒中腐敗菌的分離及初步鑒定

取少量菠蘿酒放入37℃培養箱中培養，直至出現異味及表面出現大量菌膜。利用稀釋平板法分離腐敗菠蘿酒中的腐敗細菌，先對腐敗酒原液進行梯度稀釋，稀釋倍數分別為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，分別取0.1 mL上述濃度的稀釋液涂平板，37℃倒置培養72 h，挑取單菌落進行分離純化。每個梯度做3個平行實驗[13]。

通過菌落形態、菌體形態、革蘭氏染色等方法，對所分離的腐敗細菌進行初步鑒定。

1.2.2 抑菌實驗

菌懸液制備：將分離得到的腐敗菌用無菌水稀釋，調整其濃度為106個/mL，備用。

細菌平板制備：取9 cm的平皿，倒入10 mL的細菌固體培養基，待其凝固后通過涂布法將0.1 mL的菌懸液均勻涂布于培養基表面，靜置備用。

抑菌實驗：以濾紙片抑菌法為參考，對其加以改進，方法如下：制備直徑為6 mm，厚度為2 mm的余甘果果肉圓片，用無菌水沖洗，去除多余水分。將余甘果片放在制備好的細菌平板上，并以直徑為6 mm的無菌濾紙片作為對照。

表1 腐敗菌的特征

1.2.3 乙醛測定方法

利用CH3CHO與過量的NaHSO3發生加成反應，待反應完全后，進行滴定實驗，用配制好的I2標準溶液測定剩余NaHSO3的量，并同時做空白滴定實驗。通過NaHSO3反應前后的變化，即I2標準溶液滴定時所消耗的體積之差，則可以計算出乙醛的含量[15]。

計算公式：

式中：V2——空白實驗滴定時所消耗的I2標準溶液的體積，mL；

V1——樣品滴定消耗I2標準溶液的體積，mL；

C——I2標準溶液的濃度，mol/L；

G——乙醛樣品稱樣量，g；

22.02——乙醛化學反應基本單元，g/mol。

1.2.4 余甘果果肉輔助乙醛降解特性的研究方法

1.2.4.1 余甘果果肉對乙醛降解率的影響

取干燥的具塞試管3支，分別編號為1、2、3，在1號試管（對照組）中加入5 mL乙醛（40%），2號試管中加入5 mL乙醛（40%）、0.1 g乙醛脫氫酶，3號試管中加入5 mL乙醛（40%）、0.1 g乙醛脫氫酶和1.0 g余甘果果肉，混勻蓋緊塞子，37℃放置10 h，然后測定乙醛含量。每組實驗均做3組平行實驗。

1.2.4.2 余甘果果肉添加量的確定實驗

取干燥的具塞試管5支，分別編號為1、2、3、4、5，在所有試管中加入5 mL乙醛（40%）和0.1 g乙醛脫氫酶。1號試管作為空白對照，2、3、4、5號試管分別加入0.5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g余甘果果肉，混勻蓋緊塞子，在37℃下放置10 h，然后測定乙醛含量。每組實驗均做3組平行實驗。

1.2.4.3 不同反應溫度對乙醛降解率的影響

取干燥的具塞試管3支，分別編號為1、2、3，在3支試管中均加入5 mL乙醛、0.1 g乙醛脫氫酶和1.5 g余甘果果肉，分放在30℃、37℃和40℃下放置10 h，然后測定乙醛含量。每組實驗均做3組平行實驗。

2 結果與分析

2.1 菠蘿酒中腐敗菌的分離及初步鑒定結果

分離得到4種腐敗菌，4種腐敗細菌特征見表1和圖1。

圖1 4種腐敗菌的顯微鏡圖片

由圖1可看出，1號和2號菌呈短桿狀，3號和4號為球狀，根據其菌落形態、菌體形態等特征判斷，具有細菌的典型性，均為單細胞。

2.2 余甘果果肉對菠蘿酒腐敗菌的抑制結果

用抑菌圈法測定余甘果果肉對菠蘿酒腐敗細菌，對4種主要腐敗細菌的抗性見圖2。

如圖2所示，余甘果對腐敗菌1、腐敗菌2和腐敗菌4均有不同程度的抑制作用，從抑菌圈大小看，對腐敗菌1的抑制作用最強，其次是腐敗菌2，最后是腐敗菌4，其平均抑菌圈直徑見表2，分別是15.5 mm、12.8 mm和11.5 mm。余甘果果肉對細菌3沒有抑制作用，抑菌圈直徑為0 mm。將4種細菌分別用滅菌的菠蘿汁培養發現，1號菌發酵液具有明顯的腐臭味，應該是某種導致水果腐爛的細菌；2號菌發酵液具有明顯的刺激性酸味，表面有一層薄膜，由此判斷可能是某種醋酸菌；4號細菌無明顯腐爛和酸的味道，但是有令人不愉快的氣味。結合以上抗菌實驗可以說明，余甘果對菠蘿酒腐敗菌具有很好的抗性。余甘果果肉對3號細菌無抑制作用，接種到菠蘿汁中發酵后，發酵液具有令人愉快的香氣。綜上所述，可以推斷余甘果在菠蘿酒釀造中有潛力作為抗菌物質來使用。

圖2 余甘果對4種腐敗細菌的抑制結果

表2 余甘果對4種細菌的抑菌效果

2.3 余甘果果肉對乙醛降解率的影響（圖3）

由圖3可知，對照組是只加了5 mL的乙醛（40%），經過10 h后，降低到33.88%。乙醛+乙醛脫氫酶實驗組中，由于乙醛脫氫酶作用，經10 h的反應后乙醛含量降低到18.24%，其轉化率為46.16%。在乙醛+乙醛脫氫酶+余甘果果肉實驗組中，由于余甘果果肉的加入，乙醛含量降為16.54%，乙醛轉化率51.18%，比乙醛+乙醛脫氫酶的實驗組增加5.02%。由此可以說明，余甘果對乙醛脫氫酶降解乙醛具有輔助增強的作用，可能是增強了乙醛脫氫酶的活力。

圖3 余甘果對乙醛降解率的影響結果

圖4 余甘果果肉不同添加量對乙醛降解率的影響

2.4 余甘果果肉添加量對乙醛降解率的影響（圖4）

如圖4所示，余甘果果肉添加量分別為0.5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g時，經過10 h的作用后，乙醛的含量呈逐漸降低的趨勢，與對照組（只含有乙醛和乙醛脫氫酶）相比，乙醛含量均有不同程度的降低，說明在乙醛脫氫酶和余甘果果肉的共同作用下乙醛降解。余甘果果肉添加量為1.5 g時，乙醛含量為14.67%，其轉化率為56.70%。當果肉量繼續增加到2.0 g時，乙醛含量變化不大，說明添加余甘果1.5 g/5 mL 40%乙醛（即0.3 g/mL 40%乙醛）時是最恰當的。

2.5 不同溫度對乙醛降解效果的影響（圖5）

如圖5所示，在同時添加5 mL乙醛（40%）、0.1 g乙醛脫氫酶和1.5 g余甘果果肉的情況下，分別測試不同溫度下乙醛的降解效果，37℃時降解效果最好，其次是40℃，降解效果最差的是30℃，由此說明37℃是最適合酶和余甘果共同作用的溫度。由于30℃是實驗中較低的溫度，所以相對于37℃、40℃而言揮發量減少，測定值比較高。可見，比最適溫度高的溫度不利于乙醛脫氫酶和余甘果果肉共同降解乙醛。

圖5 不同溫度對乙醛降解率的影響

3 結論

從腐敗的菠蘿酒中分離得到4種腐敗菌，經初步鑒定為細菌，分別為1號、2號、3號和4號，余甘果果肉對1號、2號和4號細菌具有較為強烈的抑制作用，抑菌圈直徑分別為15.5 mm、12.8 mm和11.5 mm，對3號細菌無抑制作用。結果表明，余甘果果肉具有抑制菠蘿酒腐敗的潛力。通過實驗表明，余甘果能夠輔助乙醛脫氫酶降解乙醛，只添加乙醛脫氫酶時，乙醛的轉化率為46.16%，同等條件下添加余甘果以后，乙醛的轉化率為51.18%，轉化率提高了5.02%。余甘果果肉的最適添加量為1.5 g/5 mL 40%乙醛（即0.3 g/mL 40%乙醛），余甘果和乙醛脫氫酶的最適作用溫度為37℃。