一株高效降解正丙醇的放線菌的篩選與鑒定

羅青春 ，趙 東 ，2，喬宗偉 ，2，鄭 佳 ，2

（1.宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓644007； 2.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓644007)

濃香型白酒作為四大香型白酒之一，在我國白酒行業中占有舉足輕重的地位。眾所周知，白酒品質及風格往往是由各種風味物質的含量與比例關系所決定。優質濃香型白酒中，四大酯類的比例為己酸乙酯＞乳酸乙酯＞乙酸乙酯＞丁酸乙酯[1]。而雜醇油是白酒中最重要的三大芳香組分之一，是3個碳以上的一元醇類物質的總稱，其主要成分是正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等高級醇[2]。但是，如果白酒中雜醇油含量過高，對人體有毒害作用，它對人體的中毒和麻醉作用比乙醇強，能使神經系統充血，使人感覺頭疼。它還是白酒苦味和澀味的主要來源之一，同時也是造成白酒出現白色渾濁的原因之一[3-4]。

目前研究中，關于降解正丙醇的報道非常少，羅惠波等[5]通過在大曲中添加糖化酶，結果正丙醇含量隨糖化酶增加有小幅度的增加，可能是由于糖化酶能把淀粉從非還原性末端水解斷裂α-1,4葡萄糖苷鍵產生葡萄糖，也能緩慢水解α-1,6葡萄糖苷鍵產生葡萄糖，而添加糖化酶后，加速了淀粉水解速度，使可被酵母直接利用的葡萄糖濃度增加，酵母會加速對糖分的代謝，而減少了對氨基酸的降解代謝，降低了正丙醇的產生量。而關于正丙醇降解菌的篩選還未見報道。

本研究從窖泥中篩選出1株正丙醇降解菌，經形態學和16S rDNA測序分析鑒定為放線菌中的原玻璃蠅節桿菌(Arthrobacter protophormiae)。這對濃香型白酒降低雜醇油提供了一種新的菌株，也對放線菌在窖泥中的功能有了新的認識。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 窖泥

實驗樣品采集：樣品取自宜賓五糧液股份有限公司窖齡為20年窖池的窖底泥，窖池分別在窖底4個角落和接近中心點的一點各取1個樣，每個樣品重量約100 g，在無菌袋中混勻后立即使用。

1.1.2 培養基

富集培養基：NaCl 1.0 g、K2HPO41.0 g、NH4Cl 1.0 g、MgCl20.5 g、NaNO31.0 g、葡萄糖 2 g，溶于500 mL蒸餾水中，酒糟20 g、黃水10 mL、曲粉6 g、酒尾20 mL，溶于500 mL蒸餾水中攪動半小時后用8層紗布過濾，再混合后用1 mol/L NaOH調節pH值至6.5～7.0。

無機鹽培養基：MgSO40.5 g、KH2PO41.0 g、NH4Cl 1.0 g、6.67 g/L CaCl23.0 mL、17 g/L FeCl33.0 mL、Fe-SO4·7H2O 0.05 g、NaNO31.0 g、不同濃度正丙醇(唯一碳源)、1000 mL蒸餾水。

保藏培養基：MgSO40.5 g、KH2PO41.0 g、NH4Cl 1.0 g、6.67 g/L CaCl23.0 mL、17 g/L FeCl33.0 mL、FeSO4·7H2O 0.05 g、NaNO31.0 g、酵母浸粉 2.0 g、1000 mL蒸餾水。

1.1.3 試劑與儀器

Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物)，SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒(上海生工生物)，氣相色譜儀(Agilent)。

1.2 實驗方法

1.2.1 正丙醇降解菌的篩選

1.2.1.1 富集培養

將窖泥樣品，以5%的接種量接種于含正丙醇4 g/L的富集培養基，30℃培養15 d。

1.2.1.2 初步篩選

把富集培養液進行梯度稀釋，并涂布于無機鹽培養基平板，挑取10株單菌落劃線純化，并接入無機鹽液體培養基中，30℃靜置培養15 d，0.2 μm濾膜過濾，取濾液進行氣相色譜檢測[6]。

1.2.2 正丙醇降解菌的鑒定

1.2.2.1 形態觀察試驗

對平板劃線的單菌落進行形態觀察。革蘭氏染色包括初染、媒染、脫色、復染等4個步驟，具體操作步驟見文獻[7]。

1.2.2.2 分子生物學鑒定

DNA提取：將篩選的降解效果最好的菌株接入保藏培養基中，30℃培養15 d，取1 mL菌液以10000 r/min離心5 min，棄上清液，收集菌體，按生工生物細菌基因組DNA抽提試劑盒(B518225)提取DNA，-20℃保藏備用。

PCR擴增：利用引物27F和1492R對細菌基因組16S rDNA進行擴增，27F：AGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。擴增體系(25μL)：10×PCR buffer2.5μL，dNTP(2.5mmol/L each)1 μL，DNA10 ng，引物 F(10 μmol/L)0.5 μL，引物R(10 μmol/L)0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。擴增程序：94℃ 4 min;94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃60 s，共30個循環；72℃10 min，4℃終止反應。

16S rDNA序列測定：利用膠回收試劑盒進行PCR擴增產物的純化；純化產物的測序工作由上海生工生物有限公司完成。

系統發育樹構建：將所測定的細菌16S rDNA基因序列分別與GenBank數據庫進行BLASTn和RDP Classifier相似性分析，選取與實驗菌株親緣關系相對較近的標準菌株用Clustalw軟件進行序列比對，采用MEGA 5軟件進行系統發育分析，構建系統發育樹。

1.2.3 正丙醇降解菌培養條件的正交試驗

挑選正丙醇降解效果最好的1株菌MBM-7，即降解率最高，對其培養條件進行優化，以培養溫度、pH值和正丙醇含量為主要參數，采用L9(33)正交設計表進行3因素3水平正交試驗，接種量5.0%，靜置培養3 d，條件如表1所示進行試驗。

表1 試驗因素與水平

降解率計算：

式中：R為降解率，%；A為空白樣正丙醇濃度，%；B為試驗樣正丙醇濃度，%。

1.2.4 統計分析

利用軟件SPSS 22對正交試驗結果進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

將窖泥的稀釋菌液涂布在正丙醇濃度分別為1 g/L、2 g/L和4 g/L的無機鹽培養基平板上，均能生長出菌落。從正丙醇濃度為4 g/L無機鹽培養基平板上挑取10株菌，在30℃、15 d厭氧培養，經過濾及氣相色譜測定后，篩選出了降解效果最好的菌株MBM-7，其降解率為37.0%(空白組正丙醇含量為3.99 g/L，試驗組正丙醇含量為2.51 g/L)。

2.2 菌株MBM-7形態觀察與分子生物學鑒定

2.2.1 MBM-7形態觀察結果

經觀察MBM-7革蘭氏染色陽性，桿狀（圖1A）；菌落呈白色、表面光滑濕潤、中間凸起、邊緣整齊（圖1B），2.0～2.3 μm×2.1～2.5 μm。

圖1 MBM-7菌體及菌落形態

2.2.2 分子生物學鑒定

GenBank登錄號是MH256113，將菌株16S rDNA序列與GenBank上的其他16S rDNA序列進行Blast分析，做進化樹(圖2)比較結果顯示，菌株MBM-7與Arthrobacter protophormiaestrain DSM 20168(NR_026195)相似性為99.9%，將該菌鑒定為放線菌目下的原玻璃蠅節桿菌(Arthrobacter protophormiae)。經RDP進行分類，其分類地位為：放線菌綱(Actinobacteria)、放線菌目(Actinomycetales)、微球菌科(Micrococcaceae)、節細菌屬(Arthrobacter)。

2.3 菌株MBM-7培養條件正交試驗結果

由于培養溫度，pH值等條件會影響其降解效果，因此需進一步優化其培養條件。以培養溫度、正丙醇含量和pH值3因素進行3因素3水平正交試驗，結果見表2。該實驗極差R可知，3種因素對菌株MBM-7正丙醇降解率的影響主次因素為B＞C＞A，即正丙醇濃度＞pH值＞溫度，同時，比較同一因素在不同水平下所對應正丙醇降解率的大小，從而得知本試驗的最佳水平組合為A2B1C3。因此最優培養條件為：培養溫度32℃、正丙醇終濃度0.1%、pH7，降解率達到91.2%。

圖2 MBM-7菌株系統發育樹圖

根據表3中3因素對菌株MBM-7正丙醇降解率的影響進行了方差分析，3個因素的F值由大到小依次為正丙醇濃度、pH值、溫度，說明正丙醇濃度對菌株降解正丙醇的影響力最大，其次是pH值，影響最小的是溫度。

表2 L9(33)正丙醇降解菌MBM-7的正交試驗結果與分析

表3 正交試驗方差分析

3 討論

目前關于濃香型白酒窖泥放線菌的報道還較少，劉茂柯等[8]利用PCR-DGGE研究了窖泥放線菌群落結構和多樣性，表明窖泥放線菌歸于Olsenella、Atopobium、Streptomyces和Corynebacterium4個屬，Olsenella、Atopobium優勢隨窖齡延長而升高。裴樂樂等[9]利用熒光定量PCR研究了不同窖齡窖泥放線菌，發現隨著窖齡的延長，放線菌數量隨之增加。此外，王濤等[10]從窖泥中分離到的Streptomyces屬的多株放線菌可產酯、酸、醛、酮和醇類等濃香型白酒中的重要呈香呈味物質。但是，至今還未見有關濃香型白酒節細菌屬（Arthrobacter）的相關報道。

本研究從窖泥中篩選出了1株正丙醇降解菌，經形態特征、16S rDNA序列分析，鑒定菌株MBM-7為放線菌中的原玻璃蠅節桿菌（A.protophormiae），系國內首次分離到了降解正丙醇的放線菌。從窖泥中篩選分離到的正丙醇降解菌MBM-7，通過正丙醇降解條件的優化實驗，MBM-7的最適降解條件為：培養溫度32℃、初始正丙醇終濃度0.1%、pH 7，在該條件下，正丙醇的降解率達到91.2%。

Labana等[11-13]研究表明，A.protophormiae能夠對污染的土壤進行生物修復。但是，至今還未見有關濃香型白酒節細菌屬(Arthrobacter)的相關報道。因此，對分離到正丙醇降解菌MBM-7放線菌的研究可能存在較大的應用前景。放線菌是窖泥中棲息的功能微生物菌群，并且對正丙醇具有顯著的降解作用，這為濃香型白酒“降雜醇油”方面的研究提供了一種新的菌株，也對放線菌在窖泥中的功能有了新的認識。