模擬濃香型白酒窖內發酵過程中主要揮發性物質的變化研究

張建敏，趙 東，鄭 佳，彭志云，楊康卓，劉 芳

(宜賓五糧液股份有限公司技術研究中心，四川宜賓644007)

濃香型白酒窖內發酵過程是一種多菌種參與的固態發酵過程。來自曲藥、窖泥及發酵環境的多種微生物（細菌、酵母和霉菌）以酒醅為載體，在白酒窖內發酵過程中進行復雜的物質能量代謝，生成各類代謝產物和風味物質。糟醅的發酵過程不僅僅包含了曲藥微生物在窖池內從有氧發酵到厭氧發酵的過程，同時包含了曲藥微生物與窖泥微生物在糟醅與窖泥接觸的界面上的相互代謝作用[1-3]。五糧濃香的雙輪底發酵，極大程度延長了窖池內窖泥與糟醅的厭氧接觸時間，糟醅與窖泥間營養物質、微生物的交換，形成了“以窖養糟、以糟促窖、糟窖互養”的良好互動局面[4-5]。傳統的釀酒經驗告訴我們，窖池邊糟（即糟醅與窖泥接觸部分的糟醅）中的風味物質的濃度顯著高于中心糟（未與窖泥接觸的糟醅）。然而，迄今還沒有開展糟醅微生物與窖泥微生物的相互代謝關系的研究。

為了解析濃香型白酒窖內發酵過程糟醅微生物與窖泥微生物的相互代謝關系，本研究模擬白酒窖內糟醅發酵情況，以五糧粉液體培養基作為載體，添加窖泥富集菌液與生產用曲粉，梯度培養并按設置節點取樣，并利用氣質聯用儀分析發酵過程中主要風味物質，以期確定主要風味物質的動態變化規律，并找到糟醅微生物與窖泥微生物的相互代謝關系。通過模擬發酵解析酒醅發酵過程中主要風味物質的動態變化關系，可為后續實驗闡明酒醅中微生物產風味物質機理，定向調控白酒生產中的主要風味物質的合成提供理論依據和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：五糧粉制備參考文獻[6]，窖泥富集液制備參考文獻[7]。

接種、培養及取樣方式見表1。

主要儀器與試劑：立式高壓蒸汽滅菌鍋為YXQ-LS，購自上海博訊實業有限公司；生物安全柜為ESCO Class II，購自珠海市珠峰儀器儀表有限公司；氣質聯用儀為6890N-5973MSD，購自安捷倫科技有限公司；二氯甲烷為ACS級，購自北京百靈威科技有限公司；4-辛醇為GC級，購自阿拉丁試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液液微萃取法(LLME)

準確量取15 mL發酵過濾液于試管中，加入適量NaCl飽和，再加入1.5 mL重蒸CH2Cl2，振蕩萃取10 min，靜置一段時間，吸取1.5 mL萃取物離心，吸取下層萃取物0.5 mL。

1.2.2 GC-MS分析條件

GC條件：DB-Wax（30.0 m長×0.25 mm內徑×0.25 μm膜厚，J&W，美國）毛細管色譜柱；進樣口溫度250℃，不分流進樣，載氣He流速1 mL/min；升溫程序：起始溫度40℃，保持5 min，以4℃/min升至230℃，保持15 min。

MS條件：EI源，電子能量70 eV；離子源溫度200℃，四級桿溫度150℃，質量數掃描范圍35～350 amu。

1.2.3 化合物鑒定與半定量分析

化合物鑒定采用參考文獻[8]所述方法進行化合物定性；單個化合物的相對含量采用其與內標響應值的比進行半定量分析。

2 結果與分析

2.1 發酵結束時揮發性成分總離子流圖（圖1）

本研究利用LLME法提取發酵液中的香氣成分，不同發酵液的色譜圖差異較明顯（圖1）。半定量風味物質共26種，包括醇類7種、酸類6種、酯類12種、酮類1種，其占總量比分別為72.17%、5.97%、21.55%、0.31%，且均為白酒基酒中已檢出的化合物。由此說明在模擬發酵體系下1#、2#、3#發酵結束時，所產最多的揮發性物質均為醇類，其次為酯類，出現這種情況可能與培養基質偏酸更適合酵母生長有關。由圖2可知，1#、2#、3#所半定量的主要揮發性物質總量的比值為3.3∶1.5∶1，2#與3#的揮發性物質的熱圖聚為一簇，說明兩者之間的風味風格有一定的相似性。

2.2 醇類

表1 接種、培養及取樣方式

本研究中，醇類化合物7種，包括苯乙醇、異戊醇、異丁醇、正己醇、正丙醇、正丁醇、3-甲基-2-丁醇，其占醇類比重分別為73.95%、23.68%、2.11%、0.20%、0.03%、0.02%，均為白酒基酒中已檢出化合物。發酵過程中的優勢醇類（苯乙醇、異戊醇、異丁醇、正己醇）在發酵中整體呈現一個積累增加的過程（圖3）。發酵結束時，發酵液中優勢醇含量的積累量比值為1#∶2#∶3#=3.9∶1.7∶1，說明大曲粉的微生物代謝五糧粉培養基產生的醇類物質最多。這是由于大曲粉中酵母菌的數量顯著多于2#，因而1#發酵液中優勢醇類積累量遠高于2#；2#發酵液中也有相當量優勢醇的積累，這可能是由于窖泥長期與糟醅接觸，兩者中微生物的互動致使糟醅中的酵母進入窖泥，從而形成一定的產醇能力。值得注意的是，3#發酵液中優勢醇類積累量均少于1#和2#，減少幅度分別為289.32%和70.61%，說明混菌培養時，優勢醇類的積累量受到很大程度的抑制，但抑制的機理仍待進一步探討。由于醇類物質具有典型的水果香、花香味[9]，不僅是酒中醇甜和助香劑的主要物質，也是形成香味物質的前驅物質，對白酒的風味有一定的作用，但是其含量必須控制在一定范圍內。含量過少會失去傳統白酒的風格，過多會導致產品辣、苦、澀，給酒帶來不良的影響[10]。所以，在濃香型白酒釀造過程中對醇類物質的調控顯得尤為重要。

圖1 發酵結束主要物質總離子流圖

圖2 發酵結束時主要物質熱圖

圖3 發酵過程中優勢醇類含量變化趨勢

圖4 發酵過程中四大酸含量變化

圖5 發酵過程中四大酯含量變化

2.3 酸類

酸類物質既是白酒的主要協調成分，也是重要的呈味物質，還是酒中酯類的前體物質。白酒中酸量過少，酒味寡淡，后味短；酸量過大，酸味露頭，酒味粗糙，甚至入口有尖酸味；適量的有機酸可使酒體豐滿、醇厚，回味悠長[11]。

本研究中定量檢測了6種酸類化合物，包括乙酸、辛酸、己酸、庚酸、3-甲基丁酸和丁酸，占酸類比重分別為64.96%、17.12%、8.81%、4.70%、3.23%和1.18%，且均為白酒中常見的有機酸。對發酵過程中的優勢酸類（乙酸、辛酸、己酸、庚酸）的定量結果可知，發酵液中優勢酸在發酵過程中也呈增加的的趨勢（圖4）。發酵結束時，發酵液中優勢酸含量的積累量比值為1#∶2#∶3#=2.5∶4.2∶1。由于窖泥中的絕對優勢微生物為細菌，大部分為產酸細菌[11]，使得2#發酵液中優勢酸積累量遠高于1#；1#發酵液中也有一定量優勢酸的積累，這可能是大曲發酵液中含有細菌產酸所致；3#發酵液中優勢酸積累量均少于1#和2#，減少幅度分別達到149.65%和318.35%，說明混菌培養時，優勢酸的積累量也受到很大程度的抑制，但抑制的機理仍不清楚。

2.4 酯類

棕櫚酸乙酯、乳酸乙酯、亞油酸乙酯、十四酸乙酯是主要的酯類物質，其占酯類比重分別為37.76%、34.07%、9.70%、9.27%。主要乙酯在發酵中的變化趨勢與酸、醇的變化結果基本一致（圖5）。發酵結束時，主要乙酯的積累量比值為1#∶2#∶3#=2.3∶0.9∶1。大曲粉中含有大量的酵母菌，另外，制曲的原料是小麥，小麥本身含有大量的棕櫚酸、油酸等，在大曲粉發酵過程中，酵母菌所含的酯化酶系可將乙醇和這類有機酸酯化產生相應的乙酯，使得主要乙酯含量高于2#；3#發酵液中主要乙酯積累量少于1#（-132.01%），而與2#基本持平，說明當大曲微生物與窖泥微生物混合培養時，大曲粉中酵母菌的酯化能力受到一定程度的抑制。

3 結論

本研究利用LLME-GC/MS探討了大曲微生物與窖泥微生物在模擬發酵體系中主要揮發性物質的變化規律，研究結果表明，在模擬發酵體系中大曲微生物、窖泥微生物、混合發酵所產主要揮發性物質是醇類。混菌培養條件下發酵液中酸類、醇類、酯類的積累均受到相當大程度的抑制。風味物質與微生物群落間的關聯性以及窖池內微生物的代謝規律特征將是我們后續研究工作的重點。