新型食用菌料酒的制備以及功能性成分的研究

李茜云，馬鵬程，郭 明 ，，李博斌，胡芳玉

(1.浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江杭州311300； 2.浙江農林大學理學院，浙江杭州311300； 3.紹興市質量技術監督檢測院，浙江紹興312071）

當前市面上的料酒主要分為勾兌料酒和釀造料酒，其中勾兌料酒主要是以食用酒精為主體，添加配料而成；而原釀料酒則采用陳年原釀黃酒為主體配制而得，釀造料酒質量明顯優于勾兌料酒[1]，但是原釀料酒在其保健營養和提鮮的功能上尚有提升的空間，故開發功能性料酒產品十分有必要。

現在研發的功能性料酒多是利用功能產品提取物進行深加工，利用共同后發酵的工藝尚少。在料酒發酵過程中，主酵及后酵前期主要進行的是酒精的積累，包括淀粉糖化和酒精發酵；后酵則主要進行料酒風味物質的沉積，這其中就包括肽和氨基酸等含氮物質的生成以及酯類等風味物質的合成。食用菌中含有豐富的氨基酸、核苷酸和多糖等營養物質和呈香呈味物質，因此，將食用菌添加到料酒的后發酵中共同釀造，能夠在保證料酒酒精度的情況下，使食用菌料酒獨特的色香味得到融合，料酒在發酵階段即可形成食用菌料酒主體滋味和香氣，發酵型的功能性料酒有較好的口感，在保留食用菌本身營養成分的同時，增強料酒的益生功能，使料酒的風格多樣化，并且發酵型的料酒促進了酒體的穩定性，同提取液勾兌的料酒相比，避免了沉淀的產生，具有良好的儲藏穩定性。開展此食用菌功能料酒的研究是極有新意的研究。

食用菌和原釀料酒中均含有豐富的氨基酸、多糖、多酚、核苷酸、蛋白質和萜類物質等非揮發性成分，該領域研究已成為熱點。張瑩等[2]對金針菇和茶樹菇中影響其滋味的非揮發性成分氨基酸和核苷酸進行分析研究，其中天冬氨酸、谷氨酸、5'-鳥苷酸和5'-肌苷酸等為代表的滋味成分；Bai等[3-4]研究發現，食用菌的抗氧化作用與多糖和多酚的含量密切相關；張穎等[5]研究發現，5種不同的食用菌多糖具有不同程度的抗氧化作用；潘孫雷等[6]研究發現，黃酒多酚的抗氧化性能改善糖尿病、心肌病大鼠的心臟功能，降低心肌組織炎癥因子和氧化應激水平，抑制糖尿病、心肌病大鼠心肌細胞凋亡。但是這些僅僅是食用菌和料酒單方面的研究，兩者共同的效果有待進一步研究。

基于此，本工作主要對釀制出的食用菌料酒中的功能性成分多糖和多酚以及氨基酸和核苷酸進行抗氧化研究和滋味活性研究。結合市場需求研發的以不同食用菌為輔料的料酒，能適合不同口味需求和養生需求的消費者，滿足廣大消費者的健康需求和消費觀念，豐富了中高檔料酒，促進了食用菌料酒的深度開發，為食用菌資源在料酒領域的開發利用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：糯米（市售優級），麥曲（生曲自制），酒藥（浙江富陽新澄酒曲），水（食用級），杏鮑菇、草菇、猴頭菇、海鮮菇、香菇、茶樹菇、平菇、灰樹花（福建盛耳食品有限公司）。

試劑及耗材：無水乙醇（AR，天津市大茂化學試劑廠），葡萄糖（AR，國藥集團化學試劑有限公司），苯酚（AR，天津市永大化學試劑有限公司），濃硫酸（AR，浙江中星化工試劑有限公司），DPPH（HPLC級，源葉生物），沒食子酸（AR，國藥集團化學試劑有限公司），碳酸鈉（AR，浙江中星化工試劑有限公司），福林酚（BR，源葉生物），甲醇（AR，國藥集團化學試劑有限公司），甲醛（AR，國藥集團化學試劑有限公司），酒石酸鉀鈉（AR，國藥集團化學試劑有限公司），氫氧化鈉（AR，國藥集團化學試劑有限公司），亞甲基藍（CP，衡水昊業進出口有限公司），亞鐵氰化鉀（AR，衡水昊業進出口有限公司），硫酸銅（AR，國藥集團化學試劑有限公司），甲基紅（IND，津東天正精細化學試劑廠），鹽酸（AR，國藥集團化學試劑有限公司），硝酸銀（AR，國藥集團化學試劑有限公司），異硫氰酸苯酯（AR，上海麥克林生化科技有限公司），17種氨基酸和2種核苷酸（美國Sig/Lma公司），乙腈（色譜純，美國Tedia公司），乙酸鈉（AR，國藥集團化學試劑有限公司），三乙胺（AR，薩恩化學技術有限公司），甲醇（色譜純，美國Tedia公司）。

儀器設備：Waters-600液相色譜儀（Waters公司，美國），UV2550紫外可見分光光度計（島津企業管理(中國)有限公司），KQ-250DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HH-6系列恒溫水浴鍋（上海科辰實驗設備有限公司），ZD-2自動電位滴定儀（上海雷磁儀器廠），磁力攪拌器（上海凌科實業發展有限公司），Sartorius電子分析天平（德國賽多利斯集團），電熱干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司），DHg/L-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司），水銀溫度計（北京普特儀表廠），電爐（嘉興市風橋電熱器廠），酒精計（億達），砂芯過濾裝置（江蘇悅成）。

1.2 試驗方法

1.2.1 食用菌料酒的發酵工藝

浸米：精選優質糯米，將清洗干凈的糯米浸泡48 h，水面高出米面10 cm；蒸飯：瀝干清水沖清，蒸到外硬內軟、疏松不糊、透而不爛、均勻一致；落缸：清水淋澆，飯溫控制在28℃，將糯米放入缸內拌酒藥，窩洞，加蓋保溫；前發酵：約48 h后，窩洞有酒液至八分滿，再倒入麥曲和放水。24 h后開耙，溫度30℃；后發酵：將粉碎成粉末的食用菌添加到罐內，攪拌均勻，發酵30 d；分離：用壓榨設備壓榨，使酒液和酒糟分離，酒槽綜合利用可作燃料，酒液中添加香辛料和食鹽（按照文獻[1]的方法添加香辛料和食鹽）；澄清：利用自然靜置法將酒液靜置7 d，取其上清液；煎酒：酒液以85℃滅菌30 min。此發酵工藝在浙江圣塔紹興酒有限公司進行工廠化小型發酵，其發酵工藝見圖1，食用菌料酒的生產原料配料表見表1。

1.2.2 8種食用菌料酒理化指標和功能性成分的測定

感官評價：依據SB/T 10416—2007的感官要求進行評價，感官評分由在浙江圣塔紹興酒有限公司有品酒經驗的技術人員和外聘評酒師10人完成，分別以色澤、香氣、滋味和體態各25分的評分標準對其進行評價，采用百分制，以平均值計。

圖1 食用菌料酒的發酵工藝流程圖

表1 8種食用菌料酒生產原料配料表

理化指標測定：總酸（以乳酸計）、氨基酸態氮（以氮計），酒精度采用蒸餾法（以酒精度計），依據SB/T 10416—2007標準；總糖采用亞鐵氰化鉀滴定法測定（以葡萄糖計），非糖固形物采用烘干測定，pH（以酸度計計），依據GB/T 13662—2008標準。

功能性成分測定：氨基酸含量和核苷酸含量的測定分別參考文獻[7]和[8]的方法；多糖含量和多酚含量的測定分別參考文獻[9]和[10]以及[11]和[12]的方法。

滋味活性值（TAV）的計算公式：

式中：TAV為滋味活性值；C為各個呈味物質在樣品中的濃度；T為對應的味道閾值。

味精當量（EUC）計算公式：

EUC為味精當量(gMSG/100 g)；ai為呈味氨基酸(Glu，Asp)的量(g/100 g)；bi為氨基酸相對于MSG的相對鮮度系數(Glu：1；Asp：0.077)；aj為呈味核苷酸(5'-GMP，5'-IMP)的量(g/100 g)；bj為呈味核苷酸相對于IMP的相對鮮度系數(5'-GMP：2.3；5'-IMP：1)；1218是協同作用系數。

表2 40種食用菌料酒的感官評分、40種食用菌料酒理化指標范圍和8種最佳配方的食用菌料酒的理化指標

DPPH的計算公式：

式中：A為DPPH與無水乙醇的吸光度；B為樣液與無水乙醇的吸光度；C為DPPH與樣液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 40種食用菌料酒的基礎評價

2.1.1 食用菌料酒的生產工藝評價

本研究采用共同發酵法的生產工藝釀造食用菌料酒，是多糖、多酚等功能性成分的良好載體，還富含氨基酸、核苷酸等營養成分。該生產工藝可應用于大規模工業化生產，在原有的釀造設備中即可進行生產，發酵工藝簡單，釀造的料酒符合現代人健康理念且具有較好營養價值。

2.1.2 40種食用菌料酒的感官評價（表2）

由表2可知，40種食用菌料酒的整體感官水平較好。由于0.5%的添加量過少，使料酒色澤呈淡黃色、口感淡薄；10%的添加量雖然營養成分含量較高，但是由于添加量過多，食用菌的菌香味濃厚，掩蓋了料酒本身的醇香味；整體來說，添加量為2.5%、5%和7.5%的料酒其色澤純正、酒體澄清、口感醇厚，酒香和食用菌香氣融為一體。其中，猴頭菇料酒的感官評價得分均較高，可能是猴頭菇中的有效成分更容易溶于酒體，灰樹花料酒的感官得分較低。

2.1.3 40種食用菌料酒的理化指標評價

40種食用菌料酒的不同添加量的理化指標的趨勢圖如圖2所示（所有理化指標的圖標注釋均按pH值的注釋）。

由表2和圖2可知，總糖、總酸、氨基酸態氮、非糖固形物和pH值隨著添加量的增加而增加，酒精度和添加量之間沒有實質性的規律。究其原因，食用菌中含有豐富的多糖，多糖分解生成單糖和二糖，所以隨著食用菌添加量的增加和后發酵的復雜反應，生成的總糖含量也隨之增加[13]；總酸含量增加可能是食用菌中含有豐富的微生物，這些有益菌隨著添加量的增加，代謝產酸也就越多[14]；食用菌中含有大量的蛋白質，因此隨著食用菌含量的增加，蛋白質含量在增加，蛋白質水解生成氨基酸態氮的含量也隨之增加[15]；總酸和氨基酸態氮的增加使非糖固形物的含量也隨著添加量的增加而增加；雖然酸度升高，但由于后發酵的過程緩慢及時間長，酒精的累積、大分子物質的分解及弱堿性物質(堿性氨基酸、核苷酸、高級醇等)的大量增加[16]，致使隨著食用菌添加量的增加，pH值也隨之增大。食用菌料酒的酒精度并沒有規律性的變化，其原因可能是主發酵和后酵前期階段主要是酒精的累積過程，因此在后酵中添加食用菌對料酒的酒精度沒有顯著影響。

圖2 40種食用菌料酒的理化指標趨勢圖

其中草菇料酒和茶樹菇料酒中總糖含量偏高，茶樹菇料酒中的總酸含量最高，茶樹菇料酒、平菇料酒、海鮮菇料酒和草菇料酒的氨基酸態氮含量超過了1 g/L，酒精度較高的是杏鮑菇料酒和灰樹花料酒，香菇料酒的非糖固形物含量較高，草菇料酒的pH值含量較高。由此可見，各食用菌同料酒共同發酵其營養物質不同，其對應的理化指標表現的風味活性成分的含量也不同。

綜上所述，這40種食用菌料酒均達到SB/T 10416—2007規定的酒精度、氨基酸態氮和總酸的行業標準的指標要求；調味料酒行業標準沒有嚴格要求的總糖、非糖固形物和pH值的理化指標參照GB/T 13662—2008的要求，除了少數料酒因添加量過多而致使pH值過大外，總糖和非糖固形物均在國標范圍。由于不同的食用菌色澤、口味和所含的營養成分（糖分、氨基酸、核苷酸、蛋白質）的含量的不同，各食用菌參與料酒后發酵微生物的代謝也不盡相同。因此，綜合考慮料酒的色澤、口感和理化指標，選擇杏鮑菇7.5%、草菇7.5%、猴頭菇10%、海鮮菇5%、香菇2.5%、茶樹菇5%、平菇7.5%和灰樹花10%的添加量作為各料酒最佳的添加量。篩選出的8種最佳配比食用菌料酒的理化指標如表2所示，均滿足標準要求。

2.2 8種食用菌料酒滋味研究

2.2.1 8種食用菌料酒的呈味游離氨基酸

氨基酸態氮為料酒行業標準中的重要指標，也是釀造料酒中原料經蛋白酶分解成氨基酸的特征性指標。氨基酸是料酒鮮味的主要來源，氨基酸中具有鮮、甜、苦、澀、酸、咸等多種味感，正是這些多種、多味的氨基酸，賦予料酒豐富的味覺層次，使酒具有鮮美、醇和、濃郁、柔潤、協調和多滋多味的特征[17]。在烹制過程中，氨基酸成分與鹽結合，生成氨基酸鈉鹽即呈味成分。然而不同氨基酸的滋味貢獻程度主要由味道強度值TAV表示，其中TAV值大于1時，說明該呈味物質對產品的滋味有顯著影響，當TAV值小于1時，該呈味作用不顯著[18]。杏鮑菇料酒（代表）的呈味游離氨基酸的色譜圖如圖3所示（其他7種類似，此處不再贅述）。

17種氨基酸的標準曲線回歸方程見表3。

經表3標準曲線方程計算得到的氨基酸含量和TAV值見表4。由表4可知，平菇料酒的總游離氨基酸含量最高（8632.3 mg/L），高于龔金炎[19]檢測到的傳統手工黃酒的總游離氨基酸（7397.1 mg/L），其次為灰樹花料酒（5942.86 mg/L）和杏鮑菇料酒（5842.5 mg/L），猴頭菇料酒（5445.59 mg/L）、茶樹菇料酒（5267.75 mg/L）和草菇料酒（5213.89 mg/L）基本在一個水平上，海鮮菇料酒（4702.16 mg/L）和香菇料酒（3693 mg/L）含量較少，其中香菇料酒的總游離氨基酸的含量最少。總體來說，食用菌料酒的總游離氨基酸含量差距較大，可能與食用菌中的生物活性成分有關。游離氨基酸含量較高的（大于450 mg/L）為谷氨酸、精氨酸、丙氨酸和亮氨酸。其中，TAV值大于1的為谷氨酸、精氨酸和丙氨酸，谷氨酸和丙氨酸分別為鮮味和甜味的代表氨基酸，精氨酸[20-21]既有甜味又有苦味，因此此食用菌料酒中的氨基酸的主要滋味物質為鮮甜味[22]。

圖3 杏鮑菇料酒17種游離氨基酸色譜圖

2.2.2 8種食用菌料酒的呈味核苷酸

表3 17種氨基酸的標準曲線回歸方程

呈味核苷酸主要包括5'-GMP，5'-IMP等，與谷氨酸鈉等鮮味氨基酸的鮮味協同效應采用味精物質的量（EUC）法分析。8種食用菌料酒的核苷酸色譜圖見圖4。

圖4 8種食用菌料酒的核苷酸色譜圖

圖5 食用菌料酒GMP和IMP的標準曲線圖

5'-IMP和5'-GMP的標準曲線回歸方程見圖5。

表4 8種食用菌料酒的呈味游離氨基酸、呈味核苷酸和味道強度值(TAV值)

經圖4和圖5的含量計算，由表4可知，8種食用菌料酒檢測到的IMP的含量在14.7～59.53 mg/L之間，GMP的含量在26.04～58.32 mg/L之間，其核苷酸鮮味值同文獻[23]對30種醬油的關于GMP和IMP均值58.87 mg/L和37.16 mg/L相當。這8種食用菌料酒中平菇料酒的IMP和GMP含量最高，海鮮菇料酒的含量最低。由TAV值可得，GMP的TAV值要遠遠高于IMP的值，說明GMP為食用菌料酒核苷酸的主要滋味物質。

2.2.3 8種食用菌料酒的等鮮濃度值（EUC）

呈味氨基酸和呈味核苷酸能共同影響食用菌料酒的滋味，其可用EUC表示。EUC表示的是呈味核苷酸與鮮味氨基酸混合物協同作用所產生的鮮味強度相當于所產生的鮮味強度所需單一味精的量[24]。由天冬氨酸、谷氨酸、IMP和GMP計算的EUC值見表5。

表5 8種食用菌料酒EUC值 (MSG/100 g)

由表5可知，其中灰樹花料酒的EUC值（1.33 MSG/100 g）最高，即100 mL食用菌料酒的鮮味強度與1.33 g MSG（味精）所產生的鮮味強度相當。其次含量較高的為平菇料酒，EUC值為1.03 MSG/100 g，其鮮味強度也較高。其中香菇料酒和海鮮菇料酒的EUC含量較低。海鮮菇料酒中的游離氨基酸含量比香菇料酒的含量高1000 mg/L，香菇料酒的核苷酸含量僅比海鮮菇料酒的含量高10 mg/L，但是在EUC含量上香菇料酒高于海鮮菇料酒，由此可驗證文獻[22]，適量的核苷酸有顯著的助鮮作用。除了谷氨酸、精氨酸和丙氨酸含量的TAV值大于1，草菇料酒和灰樹花料酒的纈氨酸TAV值、平菇料酒的TAV值以及茶樹菇料酒、平菇料酒和灰樹花料酒的TAV值均大于1，說明不同料酒的特征滋味成分和含量的不同，形成各自特有的滋味以及口感。

2.3 8種食用菌料酒多糖和多酚的抗氧化性研究

多糖與多酚的標準曲線回歸方程見圖6和圖7。

圖6 多糖含量的標準曲線

2.3.1 8種食用菌料酒多糖的含量

經標準曲線方程計算得到的多糖含量和自由基清除率見表6。

圖7 多酚含量的標準曲線

表6 8種食用菌料酒的多糖含量和自由基清除率

2.3.2 8種食用菌料酒多酚的含量

經標準曲線方程計算得到的多酚含量和自由基清除率見表7。

表7 8種食用菌料酒的多酚含量和自由基清除率

2.3.3 8種食用菌多糖和多酚的抗氧化性研究

8種食用菌多糖和多酚的抗氧化性研究見圖8、圖9。

由圖8可知，多糖的含量大小順序為茶樹菇料酒＞香菇料酒＞草菇料酒＞猴頭菇料酒＞平菇料酒＞杏鮑菇料酒＞海鮮菇料酒＞灰樹花料酒；多糖的DPPH自由基清除率的大小順序為草菇料酒＞香菇料酒＞茶樹菇料酒＞猴頭菇料酒＞平菇料酒＞杏鮑菇料酒＞灰樹花料酒＞海鮮菇料酒；多酚的含量大小順序為草菇料酒＞平菇料酒＞香菇料酒＞茶樹菇料酒＞杏鮑菇料酒＞灰樹花料酒＞海鮮菇料酒＞猴頭菇料酒；多酚的DPPH自由基清除率的大小順序為草菇料酒＞香菇料酒＞茶樹菇料酒＞平菇料酒＞灰樹花料酒＞杏鮑菇料酒＞海鮮菇料酒＞猴頭菇料酒。多糖和多酚的含量與DPPH自由基清除率均表現出一定的相關性（呈現一致的變化關系），多糖與多酚的含量與抗氧化能力順序基本一致，即含量越多，DPPH自由基清除率越強。但是，其含量和自由基清除率卻不是完全一致的順序，究其原因，可能是在醇沉多糖時，食用菌料酒中的蛋白質、鞣質和糠醛酸[25]也不溶于無水乙醇，這些物質隨多糖共同沉淀下來，并且共同溶解在蒸餾水中，從而DPPH自由基的單電子被捕捉的就多；同理，多酚也是一樣，不僅多酚可與福林酚試劑反應，蛋白質[26]（蛋白質分子中含有酚基的氨基酸如酪氨酸和色氨酸等）也可以與之反應，也能使抗氧化能力增強，因此，其含量與DPPH自由基的抗氧化能力并不是完全一致。

圖8 8種食用菌料酒多糖、多酚的含量與DPPH清除率的關系

圖9 多糖與多酚的含量對比關系以及多糖與多酚DPPH自由基清除率對比關系

由圖9可知，草菇料酒中多糖和多酚的含量均較高，茶樹菇料酒中多酚的含量與多糖的含量較其他料酒相比相差懸殊。其中，茶樹菇料酒和香菇料酒中含有較多的多糖，具有的抗氧化能力較強，此結果與文獻[27-28]報道的結果一致；草菇料酒、香菇料酒、茶樹菇料酒和平菇料酒中的多酚含量均超過了糯米紅曲黃酒[29]、王致和料酒和珍極料酒[30]等多種品種的黃酒和料酒。

由圖9可知，在多糖含量遠遠超過多酚含量的情況下，多酚與DPPH自由基清除率的相關性顯著高于多糖與DPPH的相關性，這種現象可能與發酵過程中有效成分的水解、異構化和生物大分子間的相互作用有關，亦與抗氧化作用機理密切相關[31]。酚類物質的抗氧化機制是芳香烴中苯環含有酚羥基（具有供氫的活性），可通過氫原子轉移和質子耦合的電子傳遞方式清除自由基[32-33]，食用菌料酒中不僅有料酒本身的沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、香草酸、香豆酸、阿魏酸、槲皮苷、咖啡酸等多種酚類物質[34]，而且還有食用菌中尿黑酸、安息香酚、羥基肉桂酚[35-36]等不常見的酚類物質，它們均具有酚性羥基，均能清除氧自由基，因此抗氧能力比較強；多糖的抗氧化機制仍不明確，但有研究發現，多糖一般與蛋白質結合通過傳遞一個電子或者去氫的機制清除活性氧自由基而發揮抗氧化作用[37]，因此還可能與蛋白質的含量有關，多糖的抗氧化能力弱可能是因為蛋白質的含量低，其機制還有待進一步研究。由圖9可知，草菇料酒、香菇料酒和茶樹菇多糖和多酚均具有較好的自由基清除率，且草菇料酒＞香菇料酒＞茶樹菇料酒。

3 結論

本次研發的新型食用菌料酒，同配制酒相比，避免了沉淀的形成；且在后發酵時加入食用菌，既不影響前酵產生的酒精度，且在適量的酒精下，有利于食用菌中的生物活性成分溶出。其生產的新型食用菌料酒，色澤澄清透明、香氣醇厚、酒精度低、氨基酸和核苷酸含量豐富、味道鮮爽、抗氧化能力強，且經過漫長的后發酵使食用菌料酒的色、香、味融為一體。

對8種不同食用菌料酒的開發，能滿足不同人群的需要。草菇料酒、香菇料酒和茶樹菇料酒具有較強的抗氧化能力，符合現代人健康理念且具有較好的營養價值；平菇料酒和灰樹花料酒呈香呈味作用較明顯，滿足現代人對不同口味的需求。