LC-ESI-MS/MS測(cè)定白酒中甜味劑三氯蔗糖的方法研究

周 玉，唐艷榮，余 義，劉 莎，毛從興，鄭 靜，孫 琳，劉 艷，時(shí)宏偉

(武漢天龍黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢430050)

隨著社會(huì)發(fā)展和科技進(jìn)步,人們?cè)絹?lái)越重視飲食健康問(wèn)題,其中三氯蔗糖制作的甜味劑應(yīng)用范圍較為廣泛。三氯蔗糖的主要原材料是蔗糖,并且在氯代作用下獲取非營(yíng)養(yǎng)型的強(qiáng)力甜味劑。甜味劑是白色的粉末狀物質(zhì),極易溶于水,水溶液透明,實(shí)際甜度能夠達(dá)到蔗糖的400～800倍。為此,對(duì)于甜味劑三氯蔗糖合成工藝展開(kāi)進(jìn)一步的分析具有一定的現(xiàn)實(shí)意義[1-3]。甜味劑盡管應(yīng)用范圍很廣，但是在白酒中是不允許添加的[5]。

白酒是我國(guó)的傳統(tǒng)蒸餾酒，按其風(fēng)味特征可分為各種不同的香型，雖然每種香型各有其典型風(fēng)格，但是不論哪種香型的白酒，保持適度的甜味，不僅可以遮蓋其他一些苦澀雜味，而且還能使酒體甘洌、醇厚、綿軟，但是這種甜味是來(lái)自于自然發(fā)酵產(chǎn)生的，而非添加甜味劑。風(fēng)味化學(xué)研究表明，味覺(jué)是由一定的呈味物質(zhì)引起的，酒之所以具有醇甜之感，是因?yàn)榫浦泻幸欢康奶鹞段镔|(zhì)，如高級(jí)醇、多元醇、氨基酸等，這些甜味物質(zhì)，對(duì)于名優(yōu)白酒，是由其特殊的生產(chǎn)工藝決定的，如濃香型大曲酒的低溫入池、緩慢發(fā)酵，就是為了有利于醇甜物質(zhì)的生成，無(wú)需另行添加[8]。

人工合成甜味劑可能對(duì)人體有致癌、致病的副作用[6]，因而已被許多國(guó)家限制使用。尤其在白酒行業(yè)，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》GB 2760—2014中規(guī)定白酒中甜味劑不得檢出。所以對(duì)于白酒中甜味劑的測(cè)定應(yīng)做到嚴(yán)格把關(guān)，防止白酒行業(yè)中出現(xiàn)假冒偽劣產(chǎn)品，對(duì)消費(fèi)者產(chǎn)生不利影響。目前，關(guān)于三氯蔗糖的檢測(cè)方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-10]、高效液相色譜法[4-5]、高效液相色譜蒸發(fā)散射法[12]、高效毛細(xì)管電泳-間接紫外法[18]、核殼型色譜柱-反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法[19]、紫外衍生-高效液相色譜法[21]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：市售白酒樣品4種。

試劑及耗材：三氯蔗糖（規(guī)格1 g，儲(chǔ)存溫度2～8℃，日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社）；甲醇（色譜純，美國(guó)Baker公司）；乙酸銨（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司，規(guī)格600 mL）。

儀器設(shè)備：Agilent 1260LC-Agilent 6460安捷倫三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀(安捷倫科技有限公司）；Agilent ZORBAX RX-C18安捷倫色譜柱（4.6×250 mm，5 μm，安捷倫科技有限公司）；有機(jī)濾膜(孔徑0.22 μm，天津津騰)；全玻璃微孔過(guò)濾器(規(guī)格1000 mL，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10 mg(精確至0.0001 mg)三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至100 mL)，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中保存。根據(jù)使用需要，用蒸餾水逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理方法

用一次性注射器吸取均質(zhì)樣品，經(jīng)0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾，濾液供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX RX-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為0.02 mol/L乙酸銨溶液，B為甲醇；流動(dòng)相體積比A∶B=30∶70；流速：0.4 mL/min；柱溫箱：25 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)模式；干燥氣體溫度：325℃；干燥氣體流速：6 L/min；噴霧電壓：206.8 kPa。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采取直接進(jìn)樣的方式，將目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜，分別進(jìn)行正離子模式和負(fù)離子模式全掃描檢測(cè)，得到一級(jí)質(zhì)譜圖和準(zhǔn)分子離子峰，再用惰性氣體氮?dú)夤粼撃鸽x子，獲得其二級(jí)質(zhì)譜圖及相應(yīng)的子離子。結(jié)果表明，在負(fù)離子模式下響應(yīng)值及靈敏度均高于正離子模式，因此，本方法選擇負(fù)離子電離模式。利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）對(duì)選定的定性離子和定量離子對(duì)碎裂電壓、碰撞能、保留時(shí)間、碰撞池加速電壓等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使各監(jiān)測(cè)離子豐度和信號(hào)達(dá)到最佳。負(fù)離子模式下的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

分別以0.1%乙酸-甲醇、0.1%乙酸-乙腈、2 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行樣品分離。結(jié)果表明，用2 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)物質(zhì)分離度、峰形、響應(yīng)值以及保留時(shí)間的穩(wěn)定性均優(yōu)于0.1%乙酸-乙腈、0.1%乙酸-甲醇，故本方法最終選用2 mmol/L乙酸銨-甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。圖1是三氯蔗糖在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下的MRM色譜圖。

表1 三氯蔗糖的質(zhì)譜參數(shù)

圖1 三氯蔗糖的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

線性范圍、檢出限和定量限參照呂謙、楊小玉、王玉紅等[15-19]的方法，將三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用蒸餾水稀釋，分別配制成濃度為40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、400 μg/L、800 μg/L的5種標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.2節(jié)所述的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（圖2）。

圖2 三氯蔗糖的線性相關(guān)系數(shù)

結(jié)果顯示，在40～800 μg/L的濃度范圍，所有分析物的質(zhì)量濃度x(ng/mL)和響應(yīng)值y之間線性相關(guān)系數(shù)為0.99999；以性噪比為3確定檢出限為40 μg/L，以性噪比為10確定定量限為100 μg/L。

2.3 精密度和回收率

精密度和回收率參照韓秋珍、陳璐瑩、劉亞攀等[20-21]的方法，采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，選擇常見(jiàn)的濃香型和兼香型兩個(gè)不同香型白酒酒樣及乙醇進(jìn)行三氯蔗糖檢測(cè)試驗(yàn)，成品白酒1、白酒2和乙醇3的三氯蔗糖含量均為未檢出，并向兩個(gè)樣品中分別添加濃度為200 μg/L、400 μg/L的三氯蔗糖進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定2次。共6組平行，12次檢測(cè)，結(jié)果表明，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差小于2%，且回收率均在85%～105%范圍內(nèi)，所以該方法的精密度和回收率均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.4 與國(guó)標(biāo)法比對(duì)

選擇常見(jiàn)的4種不同類型白酒酒樣添加三氯蔗糖，將本方法與國(guó)標(biāo)GB 22255—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測(cè)定》方法進(jìn)行加標(biāo)測(cè)回收率結(jié)果比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表2。

將本方法和國(guó)標(biāo)方法的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，兩組數(shù)據(jù)的絕對(duì)偏差小于1，相對(duì)偏差小于5%。國(guó)標(biāo)方法中三氯蔗糖的定量限是2.5 mg/L；本方法的檢出限是0.04 mg/L，定量限是0.1 mg/L。結(jié)果表明，本方法可以用于白酒中三氯蔗糖的檢測(cè)。相比液相色譜系統(tǒng)，液相質(zhì)譜聯(lián)用儀具有更高的分離度和靈敏度以及更短的檢測(cè)時(shí)間。

3 結(jié)論

本研究利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了白酒中甜味劑三氯蔗糖化合物的分子信息，利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀技術(shù)，建立了一個(gè)快速、穩(wěn)定、靈敏的可定性定量檢測(cè)三氯蔗糖的方法。該方法可在10 min內(nèi)完成，其檢測(cè)范圍內(nèi)線性良好（r=0.99999），檢出限0.04 mg/L，定量限0.1 mg/L，精密度＜2%，回收率＞85%，且與國(guó)標(biāo)中的檢測(cè)方法相比檢出限更低，能更加有效的監(jiān)測(cè)白酒中三氯蔗糖的含量，綜上所述，該方法可以對(duì)三氯蔗糖進(jìn)行實(shí)際的定性定量檢測(cè)。

表2 方法結(jié)果比對(duì)