實時熒光定量檢驗對結核病患者的診斷價值評價

朱小紅 胡穎君

結核病是一種嚴重的傳染性疾病, 而且近些年來愈漸呈發(fā)病率增高的態(tài)勢, 若該病能早期確診, 對患者預后和轉歸具有重要意義。以往臨床在對結核病患者的檢驗上所用的常規(guī)痰涂片抗酸染色法, 受到結核病病原菌陽性檢出率低的影響, 對結核病的早期診斷帶來一定阻礙。實時熒光定量檢驗有著操作便捷、靈敏度和特異度高的應用優(yōu)點, 在臨床上的應用也已經取得了很好反響。現具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年7月～2017年6月本院收治的100例結核病患者作為研究對象, 排除合并有嚴重的心、臟等重要器官疾病者。其中, 男50例, 女50例；年齡20～55歲,平均年齡(38.2±5.7)歲；病程15 d～7個月, 平均病程(2.7±1.5)個月。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量檢驗法 首先, 提取DNA。將取得的痰液標本收集到試管當中, 加入4%氫氧化鈉溶液, 均勻搖混, 在常溫的環(huán)境下靜態(tài)放置20 min, 直至標本出現液化, 再加入1 ml的混合液, 持續(xù)進行5 min的離心處理, 將上清液去除, 舍棄離心管里的沉淀物之后, 加進1 ml的0.9%氯化鈉溶液, 再次進行5 min的離心處理, 并取出沉淀物, 最后將50 μl的DNA提取液加入其中, 均勻的搖混之后, 在100℃的環(huán)境下放置10 min, 10 min后持續(xù)離心5 min, 放到-20℃的條件下保存, 待檢。其次, PCR擴增。將以上經過處理的樣品上清液提取出2 μl, 加到PCR反應管中, 進行1 min的離心處理, 放到儀器樣品槽中。93℃下2 min, 55℃下45 s、65℃下60 s, 上述為10個循環(huán)；93℃下30 s、55℃下45 s, 上述為30個循環(huán)。設定好陰性質控品作為陽性定量的參考數據。結合FQ-PCR軟件閥值, 獲得一條呈對數增長的擴增曲線。當擴增曲線Ct值≤36時, 確定為陽性病例；當Ct值＞40, 確定為陰性病例；若Ct值介于37～40, 那么再次進行測定, 并以再次測定獲得的結果作為評判依據, 如果再次檢驗所得Ct值還是介于 37～40, 則判定為陰性［1］。

1.2.2 涂片抗酸染色法 獲取患者的痰液標本進行涂片,至干燥之后加以固定, 進行Z-N染色處理, 采用鏡檢對所得染色結果加以觀察。

1.3 觀察指標 統(tǒng)計并比較實時熒光定量檢驗法、涂片抗酸染色法對疑似結核病患者檢驗結果。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件對數據進行統(tǒng)計分析。計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

實時熒光定量檢驗法檢測陽性例數為81例, 陽性檢出率為81.0%；涂片抗酸染色法檢測陽性例數38例, 陽性檢查率為38.0%；實時熒光定量檢驗法的陽性檢出率明顯高于涂片抗酸染色法, 差異有統(tǒng)計學意義(χ2=38.365, P=0.000＜0.05)。見表1。

表1 兩種不同檢驗方法的檢出結果比較［n(%)］

3 討論

結核病屬于一種傳染性的嚴重病癥, 是由結核分枝桿菌誘導發(fā)生的, 當發(fā)生感染之后, 便可侵入到人體全身的各個器官當中, 臨床最常見的一種結核病便是肺結核病。結核病主要是通過呼吸道感染傳染, 臨床上以飛沫感染方式最為常見。疑似患者前來就診時, 臨床多是結合其既往病史、影像學檢查結果以及實驗室檢查結果等作出最終的明確診斷。

診斷結核病的實驗室檢查方法比較多, 例如痰涂片抗酸染色法、痰培養(yǎng)和實時熒光定量檢驗方法等。其中痰涂片抗酸染色法雖然通過鏡檢能夠直接觀察到分枝桿菌, 但是卻易于受到痰液標本質量、檢驗工作者主觀因素的影響而降低檢出陽性率, 首先是非特異性, 有100多種的分枝桿菌同樣是呈抗酸染色陽性的；其次便是抗酸桿菌的形態(tài)和大小變化均較大, 會使得結果判斷出現差異；最后便是因為受到菌體分布不均的影響, 人為判讀結果時, 會由于缺乏規(guī)范化與標準化而造成客觀漏診［2］。上述這些問題均會給結核病的確診帶來很大難度。

另外, 就實時熒光定量檢驗方法來看, 是近幾年來新興并被廣泛使用的一種基因診斷技術, 它是在反應體系當中加入了1個熒光標記探針, 繼而在檢驗的過程當中, 充分借助Taq酶外切核酸酶活性促進熒光信號的釋放, 于擴增的這一過程當中, 每當模板復制1次, 便可以釋放出1個熒光信號,而基于對熒光信號強弱度的判斷, 便可精準實現對模板的定量［3］。該技術已經被廣泛地應用到對各種病原體的核酸檢測當中, 其實驗室操作不僅便捷, 而且具有檢驗高效的優(yōu)勢,整個實驗過程僅控制在3 h之內便可完成, 這可以說是在很大程度上縮短了實驗室檢驗耗費時間, 不僅有利于提高陽性檢出率, 而且在此基礎上還能盡早為臨床提供以精準的檢驗結果, 給患者及時的開展早期治療提供了便利條件。

結合本次研究結果來看, 實時熒光定量檢驗法的陽性檢出率為81.0%, 明顯高于涂片抗酸染色法的38.0%, 差異有統(tǒng)計學意義(χ2=38.365, P=0.000＜0.05)。由上述結果可知, 涂片抗酸染色法陽性檢出率比較低, 這是由于在使用涂片抗酸染色法進行檢驗時, 可能會由于受到痰液標本質量以及檢驗工作者主觀因素的影響, 導致檢測結果陽性率偏低。

另外需要強調的是, 采用實時熒光定量技術對于那些含有結核菌量比較低的樣本有著極高的應用價值, 其中采用擴增技術能明顯提高檢驗的精準程度, 無論是在尿液還是在胸腹水的檢驗當中, 均能夠提高分枝桿菌的陽性檢出率［4,5］。而且因為實時熒光定量檢驗技術是使用閉關操作,所有耗材皆為一次性使用, 實現了專區(qū)專用, 因此這也有利于降低實驗過程中的標本污染率, 從而能夠進一步提高診斷的準確率［6-8］。

綜上所述, 采用實時熒光定量檢驗法對結核病患者進行臨床診斷, 其陽性檢出率明顯高于涂片抗酸染色法, 可廣泛應用到臨床實踐中, 對結核病的病理診斷有著重要輔助作用。