攜白細胞介素-8單克隆抗體靶向造影劑對兔急性心肌梗死模型的超聲評估

陳建福，張容亮，孫 月，陸永萍

(云南省第二人民醫院超聲科，昆明 650021)

冠心病(coronary heart disease，CHD)亦稱缺血性心臟病，是當今危害人類健康和生命最主要的疾病之一，其中以急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的影響最大[1]，全世界每年至少有1 700萬人死于AMI及其并發癥，位列死亡原因之首。如何快速、準確地診斷出AMI及確定梗死區域是目前研究的重點。研究表明，白細胞介素-8(IL-8)是參與心肌梗死重要的炎性因子[2]，也是一種趨化因子。本實驗擬開胸結扎兔左冠狀動脈前降支(left anterior descending，LAD)建立兔AMI模型，應用臨床上常用的SonoVue造影劑偶聯IL-8單克隆抗體(簡稱“IL-8單抗”)制備靶向超聲造影劑[3]，對實驗動物行心肌聲學造影(MCE)檢查，并根據顯影情況，第一時間進行視覺評估，從而快速、精確地判斷梗死區域，為臨床進一步研究AMI奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年日本大耳兔32只，體質量(3.0±0.5)kg，隨機分為兩組：AMI模型組和假手術(Sham)對照組，每組16只。

1.1.2 實驗儀器 Philips iE33超聲診斷儀，S5-1探頭，頻率1.8/3.6 MHz。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 AMI組：3%戊巴比妥鈉注射液(1 mL/kg)經兔耳緣靜脈緩慢注射麻醉后，消毒、鋪巾，于兔胸骨左緣3、4肋骨水平作長3～4 cm的縱形切口,依次切開皮膚、皮下組織，分離肌肉層，充分暴露心包，剪開心包暴露心臟的手術視野，用5-0 Prolene帶針縫線連同心大靜脈一起結扎左冠狀動脈。肉眼觀察結扎遠端局部心肌顏色出現暗紅色，再變成暗紫色且搏動減弱，動態監測兔心電圖波形出現ST段上抬、壓低或病理性Q波，初步判斷模型成功建立[4]。Sham組：同一結扎點只穿線不結扎。AMI組和Sham組兔均行四肢電極連接MEDLAB-4C501H型生物信號采集處理系統，行心電監護。

1.2.2 靶向造影劑的制備

1.2.2.1 造影劑制備 采用共價偶聯法通過異型雙功能交聯劑(SPDP)將IL-8單抗偶聯于SonoVue微泡表面，獲得攜IL-8單抗的微泡懸液[5]，制備靶向超聲造影劑。

1.2.2.2 微泡懸液的鑒定 (1)玻片凝集實驗鑒定：攜IL-8單抗的偶聯造影劑微泡懸液與羊抗鼠IgG血清混合，倒置顯微鏡下可觀察到凝集反應[6]；單純SonoVue造影劑微泡懸液與羊抗鼠IgG血清混合液倒置顯微鏡下未觀察到凝集反應。(2)熒光染色實驗鑒定：攜IL-8單抗的偶聯造影劑微泡懸液表面可見熒光，單純SonoVue造影劑微泡未見熒光。

1.3 超聲心動圖及MCE檢查 各實驗兔分別于術前，術后30 min、2 h、6 h行常規心臟超聲檢查，先行SonoVue造影劑MCE檢查，間隔10 min，行攜IL-8單抗靶向造影劑MCE檢查。兩種造影劑(SonoVue造影劑、IL-8單抗+SonoVue偶聯造影劑)使用前搖勻，每次均抽取0.2 mL微泡懸液(約0.05 mL/kg)，經兔耳緣靜脈10 s內勻速推注完，并用2 mL生理鹽水沖注。取左室短軸乳頭肌水平切面觀察心肌各節段顯影，檢查過程中的動靜態圖像全部存儲用于視覺分析評估。全分析過程采用盲法，實驗動物只用編號，不標明分組。

1.4 心肌造影劑充盈視覺評估 +++：心肌造影劑顯影明顯，視頻強度明顯增強，接近左心腔內造影劑強度；++：心肌造影劑顯影一般，視頻強度低于左心腔內造影劑強度；+：心肌造影劑顯影暗淡，視頻強度明顯低于左心腔內造影劑強度；-：心肌不顯影。

2 結 果

2.1 模型建立情況 Sham組3只死亡，其中1只開胸后即死，可能與麻醉劑量不當有關，另2只于術中胸膜破裂死亡。AMI組4只死亡，其中2只于冠狀動脈結扎約1、3 h后死亡，可能與麻醉劑量不當、AMI面積過大等有關，另2只于術中胸膜破裂死亡。最后納入實驗分析的模型有25只，Sham組13只，AMI組12只。

2.2 視覺評估

2.2.1 SonoVue造影劑心肌造影視覺評估 AMI組的造影劑顯影程度明顯低于Sham組，見圖1。

橙色箭頭所示：AMI組造模節段前壁心肌顯影的充盈缺損區

圖1 Sham組和AMI組術后6 h心肌聲學造影圖

2.2.2 攜IL-8單抗的靶向造影劑行心肌造影視覺評估 攜IL-8單抗靶向造影劑行MCE檢查，AMI組各節段心肌造影劑充盈情況的視覺評估術前各節段造影劑充盈均一致，視頻強度整體偏低(與偶聯造影劑的微泡密度相對偏低有關)；AMI組術后30 min，兩造模節段前壁、前間隔充盈初期即可見造影劑充盈，中期即達峰值，中期至峰值期表現為平臺；全部充盈過程，視頻強度均強于術前，前間隔與前壁強于后間隔與下壁。術后2、6 h視覺評估與術后30 min相似，見表1。AMI組攜IL-8單抗靶向造影劑及SonoVue造影劑行MCE檢查造影劑顯影情況比較，術前兩種造影劑造模節段呈相似均勻一致充填；術后30 min，兩個造模節段攜IL-8單抗靶向造影劑顯影視頻強度均強于SonoVue造影劑；術后2、6 h視覺評估與術后30 min相似，見表2。術后30 min，Sham組心肌前壁未見明顯造影劑充盈，AMI組可見造影劑充盈；術后2、6 h視覺評估與術后30 min相似，見圖2。術后30 min，Sham組心肌前間隔未見明顯造影劑充盈，AMI組可見造影劑充盈。術后2、6 h視覺評估與術后30 min相似，見圖3。

表1 AMI組各節段心肌造影劑充盈情況的視覺評估

黃色虛線區：造模節段前壁心肌充盈初期

圖2 Sham組和AMI組攜IL-8單抗靶向造影劑

黃色虛線區：造模節段前間隔心肌充盈初期

圖3 Sham組和AMI組攜IL-8單抗靶向造影劑心肌前間隔術后聲學造影圖

3 討 論

AMI是由于冠狀動脈急性閉塞而導致部分心肌缺血性壞死的過程，常發生在冠狀動脈粥樣硬化病變的基礎上[7]。心肌缺血、梗死部位常釋放出多種炎性因子。研究證明，AMI后會出現血清IL-8水平升高,IL-8是參與心肌梗死的重要炎性因子[8-9]。本研究通過將IL-8單抗連接到聲學造影劑表面構筑成靶向聲學造影劑，使造影劑快速、主動結合到靶區，從而進行特異性的超聲分子成像，以期準確、及時地判斷局部室壁運動異常區域內有無存活心肌，為臨床選擇治療措施、療效預測和預后評估提供重要的依據[10]。

傳統二維超聲心動圖可以顯示出心室壁各部分的運動，檢出心肌梗死所致的室壁運動異常[11],但是無法在第一時間精確地診斷出心肌梗死的具體區域。行心肌超聲造影檢查時，某一區域心肌的視頻密度代表了該區域即時造影劑的濃度,因此可用MCE檢查判斷心肌血供情況[12]。當心肌微循環尚未受損時，心肌內可見聲學造影劑均勻充盈；當心肌梗死時，由于血供不足或中斷，局部節段心肌出現造影劑灌注缺損，顯影視頻強度明顯減弱[13]。

本實驗研究發現，同一實驗兔，單用SonoVue造影劑行MCE檢查時，AMI組造模節段的心肌顯影視頻強度均低于術前，均低于Sham組；AMI組造模節段的心肌顯影視頻強度均低于非造模節段。而用攜IL-8單克隆抗體的靶向造影劑行MCE檢查時，AMI組造模節段的心肌顯影視頻強度均高于術前，均高于Sham組；AMI組造模節段的心肌顯影視頻強度均高于非造模節段。在造影劑單因素不同，其他實驗因素都相同的情況下，可說明IL-8單克隆抗體與缺血心肌釋放的炎性因子IL-8之間的補體效應所致的趨化性和靶向作用。

用攜IL-8單抗的靶向造影劑行心肌聲學造影時，AMI組術后30 min即表現為造模節段造影劑充盈明顯強于非造模節段，充盈速度快于非造模節段。但從心肌微循環的角度來看，AMI組術后30 min造模節段的微循環受損并減少[14]，而側支循環尚未完全建立，MCE本應表現為充盈缺損或充盈程度低于非梗死區，而實際卻相反，由此分析得出炎性因子IL-8在AMI早期(術后30 min)增高即很明顯。攜IL-8單抗的靶向造影劑的MCE檢查對于心肌缺血的敏感性和特異性均優于常規超聲造影劑，優于傳統二維超聲心動圖，能更早期、更快速、更精準地診斷出缺血性心臟病。

本實驗研究在實際操作過程中尚存在某些不足，采用共價偶聯法制備的靶向超聲造影劑密度偏低，顯影強度不夠，可能與造影劑制備過程中操作手法不當，相關技巧、工藝尚未完全成熟有關。

綜上所述，攜IL-8單抗靶向聲學造影劑與缺血心肌所釋放的炎性因子IL-8之間存在靶向作用，攜帶IL-8單抗靶向造影劑的MCE檢查對缺血心肌診斷更準確，可早期定位診斷，是目前較為理想的檢查方法，有著廣闊的研究應用前景，靶向性心肌聲學造影技術將為人類缺血性心臟病的診療開辟一個新途徑。