豌豆根瘤菌gshR基因的抗氧化和共生固氮作用

程國軍，謝 婧，殷 杰，彭 楊

(中南民族大學 生命科學學院， 武漢 430074)

谷胱甘肽還原酶(GshR)是一個約為125 kDa的蛋白質，廣泛存在于細胞核、線粒體、過氧化物酶體和內質網中，在保護生物體方面起關鍵作用[2].GshR是依賴NADPH的氧化還原酶家族的一員，是在抗壞血酸-谷胱甘肽(ASA-GSH)循環(huán)中作為ROS解毒至關重要的抗氧化酶.高效的GshR可維持細胞中GSH/GSSH處于高值，對GSH抗氧化劑的功能非常重要[3].Ku M等[4]發(fā)現白色念珠菌gshR基因突變株喪失硫氧還蛋白1、2的基因活性，細胞成絲情況、抗氧化性質及丙酮醛含量明顯下降，以致無法存活.將谷胱甘肽還原酶編碼基因導入大腸桿菌后轉入載體，在H2O2環(huán)境下表達的GshR融合蛋白活性高于自然條件下4倍，表明GshR蛋白在機體處于不利環(huán)境時有解毒作用.李智燕等[5]對天藍苜蓿和紫花苜蓿根瘤菌CAT(過氧化氫酶)、GshR等抗氧化酶系研究表明在高濃度鋁作用下，GshR失去防御能力而被破壞，活性降低.馬占強等[6]人對苜蓿中華根瘤菌Sinorhizobiummeliloti研究表明該菌株可通過提高SOD(超氧化物歧化酶)、GshR等酶的活性，降低銅離子的毒害效應.Muglia C等[7]構建了熱帶根瘤菌RhizobiumtropiciGSH合成酶基因缺失突變株，該突變株接種菜豆宿主，形成低固氮活性的不正常根瘤.

豌豆根瘤菌3841gshR基因編碼谷胱甘肽還原酶，本文通過構建豌豆根瘤菌gshR基因突變株，進一步研究谷胱甘肽還原酶基因突變對根瘤菌抗氧化以及共生固氮的影響，為闡明谷胱甘肽還原酶在根瘤菌抗氧化體系中的作用機制提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株為野生型豌豆根瘤菌RL3841和大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，RLgshR為本次試驗構建的RL3841突變體，克隆載體 pK19mob由英國牛津大學Philip S Poole教授提供.甜豌豆種子為本實驗室保存.大腸桿菌用LB培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)，豌豆根瘤菌用AMS或TY培養(yǎng)基于30 ℃培養(yǎng).豌豆根瘤菌培養(yǎng)所用抗生素(Sigma)及濃度：新霉素(Neo)80 μg/mL,鏈霉素(Str)500 μg/mL,壯觀霉素(spe) 100 μg/mL；大腸桿菌培養(yǎng)所用抗生素及濃度：四環(huán)素(Tc)5 μg/mL,卡那霉素(Km)20 μg/mL.

限制性內切酶(XbaI、BamH I、Hind III等)、T4 DNA連接酶、RNAiso Plus、限制性內切酶均購于TaKaRa公司；TaqDNA 聚合酶、phusion 高保真酶購于Thermo Scientific公司；PCR產物及DNA凝膠回收試劑盒等購于博大泰克公司；反轉錄所用試劑為 PrimeScriptTMRT reagent Kit,FastStart Universal SYBR Green Master (Rox).

1.2 RLgshR突變菌株的構建

構建gshR基因突變株參照田夢洋等[8]方法，以RL3841總DNA為擴增模板，gshR的上游和下游引物(見表1)進行PCR反應.將pK19mob載體與目的片段分別用XbaI和Hind III雙酶切后，經T4 DNA連接酶過夜連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，轉化子經檢測后，獲得陽性重組轉化子pKgshR.再進行三親本結合實驗，其中RL3841為受體菌，大腸桿菌pKgshR為供體菌，大腸桿菌pRK2013為輔助菌，通過抗生素平板及以M13/RLgshRMP為引物的 PCR驗證，最終獲得gshR基因突變菌株RLgshR.

表1 PCR引物序列

注：____為限制性酶切位點

1.3 菌株的生長試驗

1.3.1 菌株的自由生長

將已活化的RLgshR與RL3841菌株接種于添加相應抗生素的TY培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2 d后，用AMS培養(yǎng)基洗脫、重懸，使其初始D(600 nm)=0.01，30 ℃，200 r/min恒溫搖床培養(yǎng)，間隔取樣測其D(600 nm)，3組平行試驗.

1.3.2 抑菌試驗

在BOTs的發(fā)病機理中，有兩條途徑被提出。 首先是涉及BRAF和KRAS突變的“低級”途徑。 根據這一途徑，漿液性卵巢囊腺瘤進展為漿液性BOTs，最終通過連續(xù)的組織學前驅病變導致低度漿液性上皮性卵巢癌[4]。 所有漿液性BOTs中只有2%通過這種“低級”途徑進展至癌癥。 其次是涉及p53基因突變的“高級”途徑。 大多數漿液性卵巢癌屬于這種高級途徑，沒有已知的前體。 血清BOTs可以抑制SERPINA 5和雙特異性磷酸酶4DUSP4兩種基因的活化，而它們實質上是由細胞外基質降解的特異性腫瘤抑制基因，這是侵襲性生長發(fā)病的關鍵因素[5]。

使用處于對數生長期的RLgshR和RL3841菌株，用蒸餾水洗脫，使菌懸液D(600 nm)=1，涂布于AMS培養(yǎng)基平板，待平板晾干后，分別將含有不同濃度的氫過氧化枯烯(CuOOH)、雙氧水(H2O2)濾紙片置于平板中央，30 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，3組平行試驗.CuOOH溶于95%無水乙醇，以潤有95%無水乙醇的圓濾紙片作為對照.

1.4 熒光定量RT-PCR

將活化的RL3841接種于AMS液體培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)至對數期時D(600 nm)=0.3～0.6，每種菌3個重復.菌體離心收集后，用0.5 mmol/L H2O2處理1 h，對照組用生理鹽水處理.采用Trizol法提取總RNA，經PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將其反轉錄成cDNA，再對cDNA模板進行熒光定量PCR.gshR基因熒光定量PCR的引物見表1，gyrB1為內參基因.

類菌體RNA提取時，將培養(yǎng)25 d的豌豆植株摘取根瘤放置于研缽中，加入液氮，研磨至粉狀，其后續(xù)RNA提取和cDNA制備等步驟與細菌RNA提取相同.其中對照組為無H2O2處理的AMS自生培養(yǎng)中對數期的3841菌株.gyrB1為內參基因，對類菌體中gshR基因進行熒光定量分析.

1.5 植物盆栽試驗

采用蛭石作為基質種植甜豌豆[8].將實驗室保存的甜豌豆經95%乙醇、2%次氯酸鈉水溶液表面消毒后，無菌水清洗播種于已滅菌并含有營養(yǎng)液的蛭石塑料燒杯中，每杯3顆豌豆，每種菌種3組重復，在每顆豌豆上接種1 mL相應的菌懸液.播種完畢后用蛭石掩埋、保鮮膜封口，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng).控制培養(yǎng)條件：22 ℃、濕度70%、光照培養(yǎng)16 h；20 ℃、濕度70%，黑暗培養(yǎng) 8 h .盆栽1 周后，待幼苗生長，用無菌牙簽將保鮮膜挑破，讓幼苗長出，定期添加營養(yǎng)液.4周后利用乙炔還原法測量根瘤固氮酶活.

2 結果與分析

2.1 RLgshR突變菌株的構建

按照程國軍等[9]突變體構建的方法，在含有鏈霉素和新霉素的抗性平板上長出單菌落.以利用M13/RLgshRMP為引物，對重組子進行PCR驗證，擴增出約650 bp的基因片段，得到gshR目的基因突變株RLgshR.

2.2 gshR基因突變對菌株生長的影響

將已活化的RLgor與RL3841菌株以初始D(600 nm)為0.01接種于AMS液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)，間隔取樣測其D(600 nm)，每個菌株3次重復，并繪制生長曲線(見圖1).

圖1 野生型3841菌株與RLgshR菌株在AMS培養(yǎng)基中的生長情況Fig.1 Growth curves of wild type 3841 and RLgshR strain in AMS medium

由圖1可知：RLgshR與RL3841菌株的生長變化趨勢相同.經顯著性方差分析，兩種菌株在細菌數量增長上無顯著差異，說明gshR基因突變不影響豌豆根瘤菌的正常生長.

2.3 gshR基因突變對菌株抗氧化物能力的影響

2.3.1gshR基因突變對根瘤菌抗H2O2的影響

無機氧化物H2O2對gshR基因突變株的抑菌能力結果見表2.當H2O2濃度為20 mmol/L時，RLgshR和RL3841的抑菌圈直徑無顯著差異；但當H2O2濃度分為100，500，1000 mmol/L時，RLgshR的抑菌圈的直徑分別為10.87，17.60，21.53 cm，顯著大于RL3841的抑菌圈直徑(P<0.05)，說明gshR基因突變雖不會影響豌豆根瘤菌抗低濃度H2O2的能力，但會嚴重影響其對較高濃度H2O2的抗性.

表2 不同濃度H2O2作用下RL3841和RLgshR的抑菌圈直徑

Tab.2 Inhibition zone diameters of RL3841 and RLgshR under different concentrations of H2O2

c(H2O2)/(mmol·L-1)抑菌圈直徑 / cmRL3841RLgshR203.40±0.404.07±0.211006.53±0.3510.87±0.38*50013.57±0.3517.60±0.46*100018.63±0.4021.53±0.42*

*與野生株RL3841相比，P<0.05

2.3.2gshR基因突變對根瘤菌抗CuOOH的影響

有機氧化物H2O2對gshR基因突變株的抑菌能力結果見表3.當CuOOH濃度分別為5，20，100，500 mmol/L，突變株RLgshR抑菌圈直徑分別為3.50,8.50,15.17,18.50 cm，均顯著大于RL3841的抑菌圈直徑(P<0.05),表明gshR基因突變會嚴重影響根瘤菌抗有機氧化物CuOOH的能力.

表3 不同濃度CuOOH作用下RL3841和RLgshR菌株的抑菌圈直徑

Tab.3 Inhibition zone diameters of RL3841 and RLgshR under different concentrations of CuOOH

c(CuOOH) / mmol·L-1抑菌圈直徑 / cmRL3841RLgshR52.30±0.663.50±0.30*205.73±0.478.50±0.78*10011.77±0.8115.17±0.50*50015.40±0.5618.50±0.79*

*與野生株RL3841相比，P<0.05

2.4 植物盆栽試驗

盆栽4周后，gshR基因突變株RLgshR接種豌豆植株形成紅色有效根瘤.將培養(yǎng)4周的豌豆植株利用乙炔還原法測定根瘤固氮酶活(見圖2 ).結果表明gshR基因突變對根瘤菌的共生表型和共生酶活無顯著影響.

2.5 熒光定量RT-PCR分析gshR基因的表達量

用0.5 mmol/L H2O2處理 1 h，豌豆根瘤菌3841gshR基因的表達量為生理鹽水對照組表達量的0.96±0.69倍；其在形成25 d根瘤類菌體中表達量為在自生條件下的1.26±0.17倍，經統計分析，gshR基因表達無顯著差異，說明gshR基因的表達不受H2O2和共生環(huán)境的誘導.

圖2 RLgshR和RL3841的共生固氮酶活Fig.2 Symbiotic nitrogenase activity of RLgshR and RL3841

3 討論

ROS可與氧化應激反應，無靶向性作用于脂質、蛋白質和DNA以誘導病理反應.豆科植物根瘤細胞已進化出防御系統，可維持細胞的氧化還原狀態(tài)并減輕氧化應激所造成的損害[10]，谷胱甘肽還原酶能將氧化型谷胱甘肽(GSSG) 還原成還原型谷胱甘肽(GSH)，是活性氧的清除提供重要的還原力[7].本研究發(fā)現：豌豆根瘤菌gshR基因編碼谷胱甘肽還原酶，該基因突變對根瘤菌RL3841的生長無影響，但是對有機氧化物CuOOH和較高濃度的無機氧化物H2O2十分敏感.在白念珠菌Candidaalbicans[4]、E.coil等細菌中，谷胱甘肽還原酶已被證明在抗氧化、機體解毒方面有重要作用.在乳酸乳球菌LactococcuslactisSK11[11]中發(fā)現菌株經H2O2處理，其死亡率高出自然條件下正常菌株的5.6倍.Riccillo P M等[12]研究發(fā)現熱帶根瘤菌R.tropici谷胱甘肽合成酶基因突變會顯著降低根瘤菌抗酸和氧化物能力.經H2O2處理，野生型菌株3841中gshR基因的表達量無顯著變化，說明gshR的表達不受外界H2O2的誘導.Soo J S等[13]研究發(fā)現，將Tigriopusjaponicus置于不用濃度的H2O2溶液中處理1 h，谷胱甘肽還原酶編碼基因的表達量并無顯著差異.

已有研究說明根瘤菌谷胱甘肽缺失突變會顯著降低根瘤固氮酶活[7].但本研究中豌豆根瘤菌gshR基因缺失對植物共生和根瘤菌固氮酶活均無影響，由于其他抗氧化系統對缺失有補償作用，如CAT酶、過氧化氫酶氧化應激系統可彌補細胞缺失GSH所造成的不足.