2種芽孢桿菌屬細菌對洋蔥根系遭受銅脅迫的緩解作用

任彩婷 ，王 魯 ，龐亞琴 ，徐秋曼

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

銅是維持植物生長發育所必需的微量元素之一，參與植物體內的多個生理過程.近年來，隨著工農業生產的快速發展和含銅礦產的開采，土壤中含銅量達到原始土壤的幾倍甚至幾十倍，嚴重威脅到生態系統的穩定和安全[1-2].土壤中過量的銅一方面會對植物產生毒害，影響植物的代謝機制，甚至抑制植物生長發育[3-5]；另一方面，銅會通過食物鏈進入人體，最終危害人體健康[6-7].因此銅污染問題引起了許多學者的關注，銅對各種作物的影響也多見報道[8-10].

采用物理或化學方法治理土壤重金屬污染所需成本較高，而且容易產生二次污染，治理效果不理想，因此近年來人們把研究方向轉移到生物修復和防治.芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌具有生長速度快、營養需求簡單、在植物表面易于存活與繁殖、制劑穩定、施用方便等優點[11].芽孢桿菌屬中的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是土壤中廣泛分布的一種需氧型細菌，除對人畜無害和不污染環境之外，還對生活在重金屬污染土壤上的植物有生長促進作用，因此在防治植物病蟲害和修復土壤重金屬污染方面受到了廣泛關注[12-15].如肖亞靜等[16]研究表明，枯草芽孢桿菌21可以提高玉米各組織中的POD活性和地下組織中的CAT活性；范仲學等[17]發現，每千克土壤中施用2 g枯草芽孢桿菌可以提高花生的主莖高、側枝長、植株鮮重、單株果重和飽果率，使籽粒中鎘的積累量降低25.37%.解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）也是芽孢桿菌屬中的一種好氧產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，與枯草芽孢桿菌具有很高的親緣性，目前關于解淀粉芽孢桿菌的生防多集中在植物病害防治、果蔬保鮮、增加抗鹽性等方面[18-19]，在防治重金屬污染方面還鮮見報道.

洋蔥（Allium cepa L.），又名蔥頭，屬百合科蔥屬二年生草本植物[20]，是世界上主要的蔬菜品種，也是中國主要栽培和出口蔬菜品種，具有抗菌、預防心血管疾病、降血糖、抗氧化的保健功能[21-22].洋蔥容易培養、根系發達、染色體數目較少，但對環境變化敏感，是環境監測的優選植物[23].納明亮[24]曾研究了銅、鋅、鉛對洋蔥、番茄、黃瓜等蔬菜的毒性效應，發現褐土和黃泥土基質中，洋蔥對銅的毒性響應最敏感.本課題組以洋蔥為實驗材料，研究枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌對重金屬銅脅迫下洋蔥根系生長、生理活性以及根尖細胞有絲分裂的影響，以期為植物的銅脅迫損傷修復和芽孢桿菌屬細菌發酵液在農業生產中的應用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

洋蔥，購自市場，栽種地附近沒有污染源.

解淀粉芽孢桿菌HM618和枯草芽孢桿菌77發酵液均由天津大學程景勝課題組提供.解淀粉芽孢桿菌HM618純培養發酵液，記為HM；枯草芽孢桿菌77純培養發酵液，記為BS；解淀粉芽孢桿菌HM618和枯草芽孢桿菌77混合培養發酵液，記為HM+BS.

1.2 方法

1.2.1 洋蔥的培養與處理

選取完好無損、大小均勻的洋蔥，剝掉外層的干燥鱗莖，去掉老根，置于盛有自來水的燒杯上，在室溫條件下進行生根培養，每24 h換一次水.待根尖長至2～3 cm，從中選取生長一致的40頭洋蔥，平均分成8組，分別為對照組（CK）、CK+HM、CK+BS、CK+HM+BS、Cu、Cu+HM、Cu+BS、Cu+HM+BS.將 CuSO4·5H2O用蒸餾水配成濃度為40μmol/L的溶液，將發酵液均稀釋10倍.將分組后的洋蔥移至盛有硫酸銅溶液和細菌發酵液的50 mL燒杯中進行培養，每24 h更換一次處理液.

1.2.2 洋蔥根長的測量

在處理7 d后測量洋蔥的根長，每個處理組隨機選取15條根進行測量.

1.2.3 相對電導率和丙二醛含量的測定

分別在處理 4、5、6、7 d 后，稱取 0.2 g根，在每一個試管中放入8 mL蒸餾水，放置4 h后，測定電導率R1.然后將試管放于沸水浴中加熱10 min，迅速冷卻至室溫，測其電導率R2.按下列公式計算相對電導率（Relative conductivity，REC），進行3次平行處理.根據張志良等[25]的方法測定丙二醛（MDA）含量.

1.2.4 根尖細胞染色體形態的觀察

分別在銅處理 24、48、72 h 后，于 11 ∶00—13 ∶00取材，每個處理組中隨機挑選5個根尖，水洗后，置于卡諾氏固定液中固定24 h，之后移入70%（體積分數）乙醇中，于4℃冰箱中保存.制片時，先用蒸餾水沖洗根尖，然后將根尖放入盛有1 mol/L HCl的試管中，在60℃恒溫水浴條件下解離5～6 min.用改良苯酚品紅染色液染色10～15 min，鏡檢，觀察細胞分裂是否有異常.統計出細胞分裂的個數，計算有絲分裂指數和染色體畸變率，計算公式如下：

1.3 數據統計分析

采用SPSS 22.0對數據進行差異統計學分析，用Excel程序作圖.

2 結果與分析

2.1 不同處理下洋蔥根尖的生長

用不同的處理液處理洋蔥7 d后，各處理組中的根長如圖1所示.由圖1可以看出，當銅脅迫不存在時，培養液中添加解淀粉芽孢桿菌發酵液或枯草芽孢桿菌發酵液均不會影響洋蔥根的生長，但同時添加2種發酵液則對洋蔥生長有顯著抑制作用（P<0.05）.當洋蔥用含有40 μmol/L CuSO4·5H2O的培養液處理7 d后，根長遠遠低于對照組的根長，可見洋蔥遭受了非常嚴重的銅脅迫.添加了解淀粉芽孢桿菌發酵液或枯草芽孢桿菌發酵液的處理組中，洋蔥根長顯著增加，比未添加發酵液處理組的根長分別提高了70.59%和177.94%，但仍然顯著低于未添加CuSO4·5H2O的處理組.同時添加2種發酵液的處理則對洋蔥遭受的銅脅迫不產生緩解作用.總的來看，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均對銅脅迫下洋蔥根的生長有促進作用，且后者的作用效果更顯著，但不能完全解除銅的抑制作用；同時添加2種發酵液對洋蔥遭受的銅脅迫沒有任何緩解作用.

圖1 不同處理組中洋蔥的根長Fig.1 Root length of Allium cepa L.in different treatment groups

2.2 不同處理下洋蔥根系的相對電導率

相對電導率是反映植物膜系統狀況的一個重要生理生化指標，植物在受到逆境或者其他損傷的情況下細胞膜容易破裂，造成胞質的胞液外滲，從而相對電導率增大[26].不同發酵液對銅脅迫下洋蔥根的相對電導率的影響如圖2所示.

圖2 不同處理組中洋蔥根系的相對電導率Fig.2 Relative conductivity of Allium cepa L.root in different treatment groups

由圖2可以看出，未施加銅脅迫之前，洋蔥根系的相對電導率處于較低水平，培養液中添加解淀粉芽孢桿菌發酵液或枯草芽孢桿菌發酵液能夠進一步降低根系的相對電導率，二者的作用效果同對照組相比差異不大.同時添加2種發酵液時，洋蔥根系的相對電導率小幅度增加.施加銅脅迫后，洋蔥根系的相對電導率大幅度增加，培養液中單獨添加解淀粉芽孢桿菌發酵液或枯草芽孢桿菌發酵液能夠顯著降低根系的相對電導率，尤其是枯草芽孢桿菌作用效果顯著.同時添加2種發酵液則會使洋蔥根系的相對電導率略增加.未施加銅脅迫的4個處理組中，洋蔥根系的相對電導率隨著培養時間的延長呈現先增加后降低的趨勢，在處理5 d后達到最大值；而施加銅脅迫的4個處理組中，相對電導率則隨時間呈先降低后增加的趨勢，在處理5 d后達到最小值.

2.3 不同處理下洋蔥根系的丙二醛含量

MDA是生物膜系統脂質過氧化的產物之一，其濃度高低可用來表示脂質過氧化強度和膜系統的受傷害程度，是一種重要的逆境生理指標[27].圖3顯示了洋蔥經過銅及發酵液處理后根系中MDA含量的變化.

圖3 不同處理組中洋蔥根系的丙二醛含量Fig.3 MDA content of Allium cepa L.root in different treatment groups

由圖3可以看出，未施加銅脅迫的4個處理組中，洋蔥根系的MDA含量處于較低水平，CK、CK+HM、CK+BS組的MDA含量相近，CK+HM+BS組在培養后期的MDA含量略有增加.施加銅脅迫后，洋蔥根中的MDA含量急劇增加.向含有CuSO4·5H2O的培養液中添加解淀粉芽孢桿菌發酵液或枯草芽孢桿菌發酵液后，在培養初期和中期，洋蔥根中的MDA含量顯著降低，后期解淀粉芽孢桿菌的作用效果則不顯著.2種細菌相比，枯草芽孢桿菌對洋蔥根系MDA的抑制效果更好，但同時添加2種細菌發酵液對銅脅迫造成的洋蔥根中MDA的生成非但沒有抑制效果，反而會使MDA含量小幅增加.

2.4 不同處理下洋蔥根尖細胞的有絲分裂

8個處理組中，洋蔥根尖細胞的有絲分裂指數隨時間的變化如表1所示.

表1 不同處理組中洋蔥根尖細胞的有絲分裂指數Tab.1 Mitosis index of chromosome of Allium cepa L.root tip cells in different treatment groups %

由表1可以看出，未施加銅脅迫的4個處理組中，CK、CK+HM、CK+BS組中洋蔥根尖細胞的有絲分裂指數在整個觀測期內都相近（P＞0.05），同時施加2種細菌發酵液時，細胞有絲分裂指數下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）.對洋蔥施加銅脅迫后，根尖細胞的有絲分裂指數大幅度下降，未添加細菌發酵液的銅處理組中，洋蔥培養24 h后，細胞有絲分裂指數同對照組相比降低了86.47%.添加解淀粉芽孢桿菌發酵液或枯草芽孢桿菌發酵液后，洋蔥根尖細胞的有絲分裂指數增加，尤其是枯草芽孢桿菌對細胞有絲分裂指數的增加效果更顯著.當向銅脅迫處理組中同時添加2種細菌發酵液時，洋蔥根尖細胞的有絲分裂指數降低.

2.5 不同處理下洋蔥根尖細胞有絲分裂的染色體畸變率

8個處理組中，洋蔥根尖細胞有絲分裂的染色體畸變情況如表2所示.

表2 不同處理組中洋蔥根尖細胞染色體的畸變率Tab.2 Aberration rate of chromosome of Allium cepa L.root tip cells in different treatment groups %

由表2可以看出，在觀測期內，對照組中洋蔥根尖細胞染色體的畸變率始終最低.未施加銅脅迫的CK+HM和CK+BS組中染色體的畸變率與對照組相近，也比較低；同時添加了2種細菌發酵液的CK+HM+BS組中，染色體的畸變率顯著增加（P<0.05）.施加了銅脅迫后，洋蔥根尖細胞染色體的畸變率大幅度增加，如培養24 h后的畸變率比對照組增加了273.24%.培養液中添加了解淀粉芽孢桿菌發酵液或枯草芽孢桿菌發酵液后，染色體畸變率顯著降低，尤其是枯草芽孢桿菌的作用效果更顯著.同時添加2種細菌時，畸變率與單純的銅脅迫處理組相近.

2.6 銅脅迫下洋蔥根尖染色體的畸變類型

洋蔥根尖染色體的正常和畸變類型如圖4所示.絕大多數根尖細胞的有絲分裂過程是正常的，并且可以形成2個子細胞，前期（Mitosis prophase）、中期（Mitosis metaphase）、后期（Mitosis telophase）如圖 4（a）～4（c）所示.不同濃度的硫酸銅溶液處理會誘導洋蔥根尖細胞出現染色體畸變現象，畸變類型如圖 4（d）～4（g）所示，主要有染色體粘連（Chromosome stickness）、染色體滯后（Chromosome lagging）、染色體斷片（Chromosome fragment）、染色體橋（Chromosome bridge）等.

圖4 根尖細胞染色體正常有絲分裂與畸變類型Fig.4 Normal mitosis and aberration types of chromosome of root tip cells

3 討論與結論

銅是具有雙重性的重金屬元素，土壤中的銅在一定濃度范圍內對植物有益，過量則會對植物產生毒害作用[28-29].本研究對洋蔥施加銅脅迫后，測試枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌對洋蔥遭受銅脅迫的緩解作用.結果表明，洋蔥在遭受銅脅迫后，根系生長受到嚴重影響，相對電導率和丙二醛含量顯著增加.培養液中添加了枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌時，能夠在一定程度上緩解洋蔥根系遭受的銅脅迫，但二者疊加則未產生緩解作用.

植物生長發育依賴于細胞的有絲分裂[30]，根尖細胞有絲分裂指數作為表示體細胞繁殖活動程度的指數[31]，代表著根尖分裂細胞數占分生區細胞總數的比例，其值越高，意味著處于分裂期的細胞越多，單位時間內形成的子細胞越多，植物生長越旺盛，反之則生長不良[32].銅對洋蔥根尖細胞有絲分裂造成的影響，可以通過細胞有絲分裂指數和染色體畸變現象反映出來.本研究用40 μmol/L的CuSO4·5H2O溶液處理洋蔥幼苗，根尖細胞的有絲分裂指數顯著降低，畸變率增加.枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌均能夠緩解洋蔥根尖細胞有絲分裂的異常，枯草芽孢桿菌的作用效果更顯著，但2種細菌的聯合使用則沒有緩解效果，具體原因有待于進一步研究.銅脅迫作用下，洋蔥根尖染色體細胞中出現染色體橋、染色體滯后、染色體粘連、染色體斷片等畸變現象，可能途徑為：①銅直接作用于帶負電的DNA分子，造成斷裂損傷；②銅干擾了蛋白質合成或轉錄，使得與染色體運動、DNA合成有關的物質不能形成；③銅通過干擾某些損傷的正常修復過程，阻止染色體在正常條件下的重建[33-34].