高壓均質對二十二碳六烯酸功能因子輸送體系穩定性影響

王 博，張書文，劉 鷺，逄曉陽，蘆 晶，呂加平,*，于景華*

（1.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193；2.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；3.甘肅工業職業技術學院，甘肅 天水 741025）

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）俗稱“腦黃金”，是ω-3多不飽和脂肪酸家族的重要成員，對人體具有多種重要的生理和藥理功能，如提高神經系統活性，促進腦部、視網膜發育，防治心血管疾病、炎性疾病和癌癥等[1-3]。此外，DHA對嬰幼兒視力完善和智力發育具有重要的意義，據報道母乳脂肪中DHA含量是牛乳的3 倍多，它們在母乳中以磷脂的形式天然存在，而牛乳作為嬰幼兒奶粉的主要來源，其所含的DHA含量極少，遠不能滿足嬰幼兒發育的正常需要[4-6]。1994年，聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織在聯合專家報告《脂肪、油脂與人類營養》中推薦在嬰幼兒奶粉中添加DHA，用來補充由非母乳喂養嬰兒的這種重要營養物質的缺乏。2001年，美國食品藥品監督管理局在GRAS Notice No.000080中批準了DHA在嬰幼兒配方奶粉中的應用。

微藻油脂是一種從人工培育的海洋微藻中提取、未經食物鏈傳遞的純植物性DHA原料，是目前世界上較純凈、安全的DHA來源。藻油中的DHA以天然的甘油三酯形式存在[7]，與母乳中的多不飽和脂肪酸存在形式相同，易被人體消化吸收，生物利用率較高；我國衛生部于2010年發布第3號公告，將DHA藻油列入新資源食品，并允許其在嬰幼兒食品中添加[8]。但藻油的水溶性差、密度比胃液小，直接食用易造成反胃，同時還具有令人不愉悅的魚腥味，限制了其應用范圍。另外，其含有多個雙鍵，遇光、氧和熱易發生氧化還原反應，產生的過氧化脂質等氧化產物對人體易造成極大的危害[9-10]。基于藻油的這些特點，選用合適的乳化劑制備出O/W、W/O/W型乳狀液，作為DHA功能因子傳遞系統添加到嬰幼兒配方奶粉等食品中是最為常見的方式。

美拉德反應制備的蛋白-多糖共價復合物可以提高蛋白質的溶解性、降低蛋白質過敏反應，具有良好的乳化、抗氧化、抑菌、保護心血管疾病和預防腸道炎癥等功能特性，可作為多功能食品添加劑應用到食品工業中[11-15]。酪蛋白酸鈉（sodium caseinate，NaCN）作為酪蛋白的一種鈉鹽，是一種安全無害的乳化劑和增稠劑，普遍應用于食品工業，GB/T 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》指出NaCN可作為DHA和花生四烯酸的載體添加到嬰幼兒配方食品中[16]；而葡萄糖（glucose，glu）是生物體內新陳代謝不可缺少的營養物質，很容易被吸收進入血液中，它的氧化反應放出的熱量是人類生命活動所需能量的重要來源，因此被廣泛應用于食品、醫藥工業。

本研究在實驗室前期有關NaCN-glu美拉德反應產物（Millard reaction products，MRPs）制備工藝研究的基礎上，以NaCN-glu MRPs為乳化劑，結合靜態光散射、紫外-可見光譜分析技術和激光共聚焦技術等對不同的均質條件下制備出的O/W型DHA藻油乳狀液的物理穩定性、氧化穩定性以及微觀結構進行了分析。利用穩定性分析儀對不同均質壓力下制備的乳狀液的物理穩定性進行快速分析；通過測定乳狀液在7、14、21 d和28 d室溫貯藏期間的總氧化值（total oxidation value，TOTOX）來反映油脂的氧化程度；以尼羅紅為熒光探針，利用激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）對乳狀液的微觀結構進行觀察，以期篩選出制備DHA藻油乳狀液的最佳工藝條件，擴大DHA藻油等水不溶性、易氧化敏感物質在嬰幼兒配方奶粉等食品中的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NaCN（純度不小于97%）、D-（+）-葡萄糖（分子質量180 Da）、Life’sTMDHA S40-O400藻油 荷蘭皇家帝斯曼集團；尼羅紅、過氧化氫異丙苯 美國Sigma Aldrich公司；p-茴香胺 美國Alfa Aesar試劑公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

T25 Digital高速剪切儀 德國IKA公司；AH100D高壓均質機 ATS工業系統有限公司；SPAKK酶標儀帝肯（上海）貿易有限公司；Turbiscan AGS穩定性分析儀 法國Formulation公司；Andor Revolution XD CLSM 英國牛津儀器公司；小型超高溫瞬時滅菌（ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT）設備 北京博華精遠科技開發有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MRPs的制備

配制質量分數為5%的NaCN溶液，充分水合后按蛋白質與糖質量比1∶1向其中加入葡萄糖，用0.2 mol/L NaOH溶液調節起始pH值為8.0；利用小型UHT設備在130 ℃下熱處理15 s，得到NaCN-glu MRPs。

1.3.2 乳狀液的制備

將1.3.1節得到的MRPs溶液作為水相，向其中緩慢加入質量分數10% DHA藻油（油相），在中等剪切速率下剪切3 min得初始乳狀液，然后經高壓均質機在35、65、95、125 MPa的均質壓力下均質3 次得到最終的乳狀液，冰水浴立即冷卻，作為實驗組NaCN-glu，4 ℃冷藏備用。以單獨的NaCN為水相在相同的條件下制備DHA乳狀液，記為對照組NaCN。在95 MPa下對NaCN-glu MRPs制備的初乳狀液均質1、2、3、4、5 次，冰水浴立即冷卻，4 ℃冷藏備用。

1.3.3 乳狀液物理穩定分析

利用Turbiscan AGS穩定性分析儀對乳狀液的穩定性進行快速分析。儀器采用近紅外作為光源，與透射光檢測器和背散射光檢測檢測器組成測量探頭，對樣品池從底部到頂部每40 μm掃描一次，在一定時間內連續掃描，獲得透射光與背散射光信號對樣品高度的函數曲線圖，即可反映出樣品中顆粒的運動趨勢，根據光強度值的偏差計算出樣品穩定性指數，進而預測乳狀液的穩定性。取1.3.2節中制備的乳狀液20 mL于樣品瓶中，將樣品瓶放入檢測池中，檢測溫度設定為25 ℃，每1 h掃描一次，掃描24 h，記錄掃描圖譜。實驗重復測定3 次。

1.3.4 乳狀液氧化穩定性分析

1.3.4.1 PV的測定

參照Zou Long等[17]的方法略作改動測定乳狀液的過氧化值（peroxide value，PV）。取0.3 mL樣品于2 mL離心管中，加入1.5 mL異辛烷-異丙醇（體積比3∶2）溶液，漩渦振蕩30 s后2 000 r/min離心5 min；取0.2 mL上清液于10 mL離心管中（以200 μL異辛烷作為空白），加入2.8 mL甲醇-正丁醇（體積比2∶1）溶液，再加入15 μL硫氰化鉀和15 μL FeSO4溶液，漩渦振蕩；室溫避光反應20 min，用SPAKK酶標儀在510 nm波長處測OD值。PV用過氧化氫異丙苯的標準曲線（5、10、50、100、500、1 000 μmol/L過氧化氫異丙苯溶解在甲醇中）定量，計算公式如式（1）所示。

式中：OD510nm為測得樣品的OD值；a為標準曲線斜率；b為標準曲線與y軸的截距。

1.3.4.2 p-AnV的測定

p-茴香胺值（p-anisidine value，p-AnV）參照AOCS Official Method Cd 18-90 American oil chemists society及文獻[18]的方法測定。取2 mL樣品于25 mL容量瓶中，用異辛烷定容混勻后轉移到50 mL離心管中，漩渦振蕩20 s后5 000 r/min離心10 min；取上清液（空白組為異辛烷），在350 nm波長處測吸光度A1。取上清液5 mL（空白組為5 mL異辛烷）于10 mL離心管中，加入1 mL p-茴香胺溶液，漩渦振蕩10 s，室溫下孵育10 min，350 nm波長處測吸光度A2，p-AnV計算公式如式（2）所示。

1.3.4.3 TOTOX的測定

PV和p-AnV分別表征油脂一級和二級氧化產物的含量，乳狀液的TOTOX程度包括對一級和二級氧化產物的檢測。用TOTOX表示乳狀液中油脂的氧化程度更為全面[19]，其計算公式如式（3）所示。

1.3.5 乳狀液的微觀結構觀察

參照Gallier等[20]的方法略作改動。將制備好的乳狀液稀釋100 倍，取0.5 mL稀釋乳狀液加入10 μL熒光染料尼羅紅，輕輕翻轉混勻后避光染色20 min。取染色后的樣品100 μL與瓊脂（10 g/L）按體積比1∶1混合，迅速充分混勻后取10 μL染色后樣品滴在載玻片上，并迅速蓋上蓋玻片。用CLSM觀察，He/Ne激光器為激發光源，尼羅紅激發波長為514 nm。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 均質壓力對乳狀液穩定性的影響分析

2.1.1 乳狀液物理穩定性分析

圖1 不同均質壓力下NaCN-glu制備的DHA藻油乳狀液Turbiscan掃描圖譜Fig.1 Turbiscan test of DHA algae oil emulsions prepared by NaCN-glu under different homogeneous pressures

圖2 不同均質壓力下NaCN制備的DHA藻油乳狀液Turbiscan掃描圖譜Fig.2 Turbiscan analysis of DHA algae oil emulsions prepared with NaCN under different homogenization pressures

本研究制備的DHA藻油乳狀液總固形物含量較高，幾乎沒有透射光，所以選擇背散射光強度（backscattering，BS）對樣品進行分析。圖1、2中橫坐標從左到右代表樣品瓶底部、中部和頂部，縱坐標為BS差（ΔBS，以第一次掃描結果為參比）。所有樣品均呈現底部的ΔBS逐漸減小后增加，頂部的ΔBS先增加后減小的趨勢。根據BS隨體系濃度的減小而減小的理論[21]，實驗組和對照組樣品均在底部出現澄清層，在頂部出現脂肪上浮層，并且頂部脂肪上浮后顆粒之間發生了絮凝，使ΔBS減小；圖中的峰寬代表澄清層和脂肪上浮層的厚度[22]，可以看出兩組樣品的澄清層和脂肪上浮層的厚度在一定均質壓力范圍內與壓力的大小成反比。

在相同的條件下，實驗組NaCN-glu的頂部和底部的ΔBS、澄清層和脂肪上浮層厚度均小于對應的對照組NaCN樣品，證明NaCN經美拉德反應改性后的乳化性有明顯提高；圖1a和圖2a、b的中部BS不重合，說明顆粒粒徑變化明顯，但與圖1a、2b相比，圖2a的BS波動幅度更大，即圖2a的粒徑變化更大，乳狀液更不穩定。實驗組中，隨均質壓力的增加，底部ΔBS絕對值的最大值從8.24%減小到2.58%，ΔBS的絕對值越小體系越穩定，所以在一定的壓力范圍內，均質壓力越大，樣品的底部越穩定，出現底部澄清的情況越不明顯，對照組也表現為同樣的趨勢。對于實驗組，樣品頂部的穩定性表現為隨均質壓力的增加先增大后減小的趨勢，ΔBS從26.72%減小到18.77%又增大到34.38%；對照組中除圖2a的底部、中部和頂部的穩定性都較差外，圖2b～d的頂部穩定性與實驗組表現出相同的趨勢。

為更直觀地對比組間、組內樣品穩定性的差異，利用TurbiSoft Lab軟件計算得到Turbiscan穩定性系數（Turbiscan stability index，TSI）對乳狀液的整體穩定性進行分析。TSI值綜合反映樣品在整個放置時間濃度和顆粒粒徑的變化幅度，變化幅度越大，TSI值就越大，體系就越不穩定。圖3為不同均質壓力下實驗組和對照組樣品的TSI值。實驗組所有樣品的TSI值均小于對照組，分別為4.75、1.70、1.55和2.10，說明NaCN-glu制備的乳狀液的穩定性明顯優于單獨的NaCN。隨著均質壓力的增大，實驗組樣品的TSI值先減小后增大，即樣品穩定性先增大后減小，與Turbiscan掃描圖譜的結果一致。當均質壓力大于95 MPa時，樣品的穩定性減小，可能是因為均質壓力過大，使油相形成的油滴過小，比表面積急劇增大，體系內的乳化劑并不足以包埋全部的油滴或不能在油滴外形成良好的保護層，沒有足夠的靜電排斥或空間位阻作用，導致油滴間易發生絮凝、聚結和分層，甚至是相分離[23-24]，所以均質壓力過大反而使體系更不穩定，當均質壓力為65、95 MPa時，兩個樣品的TSI值較小，但差異并不明顯，所以均質壓力控制在65～95 MPa間較好；對照組也表現出相同的趨勢。

圖3 均質壓力對DHA藻油乳狀液TSI值的影響Fig.3 Effect of homogenization pressure on TSI of DHA algae oil emulsion

2.1.2 乳狀液氧化穩定性分析

油脂氧化的初級產物是不穩定的氫過氧化物，易分解生成具有不愉快氣味的小分子醛、酮、醇和酸等二級氧化產物，這些氧化產物不但會對食品的外觀、口感、營養價值和貨架期產生不良的影響，而且氧化過程中產生的自由基也會嚴重危害人體健康，導致機體損傷、細胞破壞、人體衰老等[25]。藻油因含有大量的多不飽和脂肪酸，易氧化變質，因此測定DHA藻油乳狀液的氧化穩定性具有重要的意義。

圖4 NaCN與NaCN-glu制備的DHA藻油乳狀液在28 d室溫貯藏期間的TOTOXFig.4 TOTOX of DHA algae oil emulsions prepared with NaCN and NaCN-glu during 28 d room temperature storage

由圖4可知，實驗組所有樣品的TOTOX在同一時期均低于相應的對照組，并隨時間的延長差異逐漸變大，說明NaCN與葡萄糖的MRPs除具有良好的乳化性外，還具有一定的抗氧化作用，與Augustin等[26]的報道一致；對照組樣品在貯藏第14天時TOTOX明顯升高，在21 d時35 MPa處理組樣品的TOTOX已超過8，此時油脂已經氧化變質[27]，而實驗組樣品的TOTOX在28 d時才有明顯的增長，直到28 d時所有樣品的TOTOX均未出現大于8的情況。

各組樣品的TOTOX隨均質壓力的增大，呈先減小后增大趨勢，這與其物理穩定性有一定的關系。當體系內的乳化劑在油滴外形成致密的界面層時，油滴與氧氣、促氧化劑等接觸的機會大大減少，在一定程度上抑制或延遲了油脂氧化，從而表現出良好的氧化穩定性[28]。其中實驗組95 MPa處理的樣品TOTOX在7、14、21 d和28 d始終為同一時期樣品的最低值，分別為0.095、0.331、0.570、6.280，所以可以進一步確定95 MPa為本研究制備DHA藻油乳狀液較為合適的均質壓力。

2.1.3 乳狀液的微觀結構分析

乳狀液屬于多分散體系，當乳狀液中大、小液滴共同存在時，小液滴有自動減小（溶解）的趨勢，大液滴有增大的趨勢；因此液滴分布均勻的乳狀液比相同平均粒徑但液滴分布不均勻的乳狀液更穩定。由圖5可知，隨均質壓力的增大，樣品粒徑明顯減小，壓力在35～95 MPa時，油滴呈現為完整的脂肪球形態；當壓力達到125 MPa時，部分油滴已經呈碎片狀，說明均質壓力對乳狀液的粒徑形態、大小和分布具有明顯的影響，進而影響乳狀液的穩定性。在35 MPa和65 MPa壓力下，油滴的粒徑較大，分布并不均勻，而125 MPa的樣品油滴粒徑過小使體系的表面自由能明顯增大，有明顯的聚集現象。對于95 MPa處理的樣品，油滴呈現較好的狀態，大小、分布較為均勻，不易絮凝或聚集，乳狀液相對穩定。由此可見，在一定的壓力范圍內，提高均質壓力可以帶來更好的乳化效果，但均質壓力過大反而使乳狀液更易發生不穩定現象，易出現聚集、絮凝、分層甚至破乳。

圖5 不同均質壓力下NaCN-glu制備的DHA藻油乳狀液中油滴分布情況Fig.5 Oil droplet size distribution of DHA algae oil emulsions prepared with NaCN-glu under different homogenization pressures

圖6 不同均質壓力下DHA藻油乳狀液中油滴的粒徑分布Fig.6 Particle size distribution curves of DHA algae oil emulsions under different homogenization pressures

在CLSM下隨機選擇200 個油滴，對其粒徑大小、分布進行分析（125 MPa的樣品已經成為較小的碎片或聚集成團，失去統計意義）。由圖6可知，樣品粒徑呈正態分布趨勢，隨均質壓力的增大，粒徑分布曲線逐漸左移，即粒徑逐漸從0.69 μm減小到0.53 μm，同時峰寬逐漸變窄，從雙峰分布變成單峰分布。這是因為在一定均質壓力范圍內，隨著均質壓力的增加，機械作用變大，油相被分散，原先未被細化的大顆粒或小顆粒聚集體被分散，粒徑不斷下降，大小趨向均一，此變化趨勢同畢爽等[29]的報道一致。由此，乳狀液的微觀結構再次證明95 MPa的均質壓力下，DHA藻油乳狀液的穩定性更好，與2.1.2節結論一致。

2.2 均質次數對乳狀液穩定性的影響分析

圖7 均質次數對DHA藻油乳液TSI值的影響Fig.7 Effect of homogenization cycles on TSI of DHA algae oil emulsion

以NaCN-glu作為乳化劑在95 MPa的均質壓力下，均質1、2、3、4、5 次制備DHA藻油乳狀液，利用Turbiscan穩定性分析儀對其TSI值變化進行分析。由圖7可知，樣品的TSI值隨均質次數的增加，呈先減小后增大趨勢，均質3 次時樣品的TSI值最小，穩定性最好；均質4 次時樣品的TSI值有輕微的增加；而均質1 次和5 次的樣品在開始掃描的1 h內，TSI值就明顯升高，樣品較不穩定，說明均質次數過少或過多都會明顯影響DHA藻油乳狀液的穩定性。

均質次數過少，機械力作用時間短，油相未被良好地分散，體系內依舊存在很多大油滴或小油滴聚集體，穩定性較差，TSI值較大；當均質次數達到3 次時，油相被分散為較小的油滴，通過吸附體系內的蛋白質乳化劑，使蛋白質乳化劑的疏水基與油相結合，親水基與水相結合，從而在兩相間形成界面膜，得到穩定性較好的包埋結構，粒徑較小且分布均勻，穩定性較好，TSI值減小，與Floury等[30]的報道一致；若繼續增加均質次數，油相被分散的程度過大，比表面積的增大使體系內有限的乳化劑不能覆蓋新增加的界面，并且對已形成的相對穩定的乳化體系造成不利影響，嚴重時會使油相、水相徹底分離，發生破乳；同時均質時產生的熱效應會對蛋白質乳化劑的乳化性質、構象產生一定的影響，使蛋白質間的疏水相互作用增加，易發生橋聯絮凝[31]，導致體系穩定性降低，TSI值增加，與毛立科等[32]的報道一致。綜上，本研究選擇的均質次數為3 次，此時得到的DHA藻油乳狀液穩定性較好，且能耗較少。

3 結 論

根據穩定性分析儀分析、貯藏期間乳狀液的氧化程度分析和CLSM觀察對NaCN-glu MRPs在不同均質條件下制備的DHA藻油乳狀液的穩定性和微觀結構進行研究，以相同條件下單獨NaCN制備的DHA藻油乳狀液作為對比，進一步證實了NaCN-glu MRPs優良的乳化性和抗氧化活性，確定NaCN-glu MRPs制備DHA藻油乳狀液的最佳工藝條件為均質壓力95 MPa、均質3 次，此時Turbiscan穩定性分析儀24 h的掃描結果顯示DHA藻油乳狀液的穩定性優于其他各組，ΔBS變化較小，只有輕微的脂肪上浮和底部澄清；室溫貯藏28 d期間的TOTOX處于較低水平，CLSM觀察乳狀液中油滴的粒徑較小，主要分布在0.47～0.59 μm之間，且形態完整、較為均一。

本研究利用小型UHT設備制備NaCN-glu MRPs，避免水浴、油浴等實驗方法的弊端，提高生產效率的同時獲得了工業生產所需的實驗數據，加速和推進實驗室成果走向工業化生產。同時，本研究為DHA等敏感易氧化的功能因子輸送體系的制備及其在嬰幼兒配方奶粉等食品中的應用提供技術支持。