冷激處理減輕茄子冷害與活性氧代謝的關系

張婷婷，姚文思，朱惠文，金 鵬，許婷婷，鄭永華*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

茄子（Solanum melongena L.）果實富含多酚、膳食纖維和維生素等營養物質，具有降血脂、預防II型糖尿病、保肝、抗氧化等多種保健功效，深受消費者的青睞[1]。茄子果實采后在常溫貯藏過程中極易發生失水萎縮、花萼變色，并易受微生物侵染出現腐爛，從而失去商品價值[2]。冷藏是果蔬采后最有效的保鮮方法，但茄子為冷敏性果實，當貯藏溫度低于7～10 ℃時，就會出現果皮脫色凹陷、果肉和種子褐變等冷害癥狀，直接影響其商品價值和貯藏品質[3]。因此，對茄子冷害發生機理及其控制措施的研究，一直是茄子采后貯藏技術研究中的重要內容[4-5]。

冷激處理是將果蔬置于低溫條件下進行短時間處理，從而提高自身抗逆性的一種物理處理方法，其對果蔬保鮮作用的研究始于20世紀70年代末。Inaba等[6]的研究發現采用0 ℃冰水混合物短時處理番茄果實，可保持果實的品質，延長其貯藏期，并將這種低溫逆境效應稱為“冷激效應”。隨后的研究表明，冷激處理能有效抑制香蕉、黃桃和甜櫻桃果實常溫貯藏期間呼吸作用等生理代謝，延緩果實硬度下降等后熟衰老進程，更好地保持果實原有的風味及營養品質[7-9]。冷激處理還可顯著提高黃瓜[10]、辣椒[11]、香蕉[12]和甘薯[13]等果蔬的抗冷性，從而減輕低溫貯藏時冷害的發生。這些結果表明，冷激處理在果蔬保鮮中具較好的應用前景。但冷激處理對茄子果實低溫貯藏期間冷害發生的影響及其相關生理機制鮮見研究報道。為此本實驗研究了不同條件冷激處理對茄子果實冷害、活性氧代謝及脯氨酸和可溶性糖等滲透調節物質含量的影響，以明確冷激處理減輕茄子果實冷害的作用和適宜條件，并從活性氧代謝的角度闡明其作用機理，為冷激處理在茄子冷鏈物流保鮮中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試茄子采購于南京市眾彩物流市場，品種為‘大龍’。采購后立即運回實驗室，選擇形狀、大小一致，成熟度、色澤基本相同，且無病蟲害和機械損傷的茄子果實，保留茄子萼片和1 cm長的果梗。

氫氧化鈉、抗壞血酸、過氧化氫、硫代巴比妥酸南京杰汶達試劑器材有限公司；乙二胺四乙酸二鈉、甲硫氨酸、氮藍四唑、對氨基苯磺酸、α-萘胺、核黃素 國藥集團化學試劑有限公司；三氯乙酸、鹽酸羥胺 上海凌峰化學試劑有限公司；沒食子酸、Folin-Ciocalteu試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

UV-1600分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；FA1104電子天平 上海精密科學儀器有限公司；GL-20G-H冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；HP-2132色差儀 深圳漢譜光彩科技有限公司；DDS-11A電導儀上海第二分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

將挑選好的茄子果實隨機分為對照（不作任何處理，CK）組和冷激處理組，其中4 個冷激處理組分別用0 ℃冰水混合物浸泡10、20、30、40 min。冷激處理方法：選用0.64 m×0.42 m×0.22 m的白色泡沫盒為冰水浸泡容器，往容器中倒入提前預冷到4 ℃的清水，之后加入制冷機所制造的小碎冰，使得冰水混合物體系的溫度穩定在0 ℃，再將果實完全浸泡在冰水混合物中，料液比為1∶10（m/V）。每個處理組120 個茄子，重復3次。處理后的茄子果實經晾干后與對照組果實分別用0.01 mm厚聚乙烯薄膜袋分裝，每袋8 個茄子，袋口用普通橡皮筋繞兩道，于（4±1）℃、相對濕度為85%～90%的恒溫箱中貯藏15 d。冷藏期間每3 d于各組隨機取3 袋，置于（20±1）℃貨架2 d后測定冷害指數和果肉色差值，確定20 min冷激處理能最顯著地減輕茄子果實的冷害；因此在后續實驗中研究了0 ℃冰水混合物冷激處理20 min對茄子果實冷藏期間活性氧代謝和滲透調節物質含量的影響，以探討冷激處理減輕茄子果實冷害的機理。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 冷害指數和果肉色差測定

參照郭雨萱等[5]的方法測定冷害指數。每次從恒溫箱中取18 個果實，于（20±1）℃貨架貯藏2 d。先按冷害程度分為5級。1級：無冷害；2級：輕度冷害，果面有少許直徑小于0.5 cm的凹陷褐色斑點；3級：中度冷害，果面褐色斑塊增大，出現直徑大于1 cm的燙傷狀斑；4級：嚴重冷害，褐變斑塊連成片，果面褐變面積未達1/3，果肉、種子輕微褐變；5級：極嚴重冷害，果肉、種子嚴重褐變，已無商品價值。冷害指數按照式（1）進行計算。

參照Concellón等[14]的方法測定果肉色差L*值。貨架貯藏2 d后，用色差儀對果肉色差進行測量，在茄子中間部分取厚度為0.5 cm的圓形截面，切取后迅速用色差儀進行測量L*值。果實褐變程度的評價標準：L*值≥80為優質的果肉顏色，無褐變；L*值在78～79之間，種子出現褐變；L*值接近77，果肉和種子出現初期褐變；L*值≤75.5，果肉和種子出現嚴重褐變。

1.3.2.2 相對電導率和MDA含量測定

相對電導率測定參照Wang Qing等[15]的方法，略作修改。用圓筒打孔器從5 個茄子中取直徑10 mm、厚度3 mm的果肉切片，將切片置于2 g于試管中，用0.6 mol/L甘露醇定容至25 mL，立即用電導儀測定電導度（L0），在室溫下靜置2 h后再次測定電導度（L1），最后放入100 ℃沸水浴中沸騰15 min，冷卻后再一次測定電導度（L2）。相對電導率按式（2）進行計算。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法[16]測定。分別測定上清液在450、532、600 nm波長處的吸光度，單位為nmol/g，結果以鮮質量計。

1.3.2.3 脯氨酸含量和可溶性糖質量分數測定

脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定[17]，單位為μg/g，結果以鮮質量計；可溶性糖質量分數采用蒽酮試劑法測定[18]。

1.3.2.4 總酚含量和DPPH自由基清除率測定

總酚含量采用Folin-Ciocalteu法測定[19]。稱取2 g冷凍的樣品，用5 mL體積分數80%的冷丙酮溶液（含體積分數0.2%甲酸）提取，研磨成勻漿后（冰浴），于4 ℃、12 000×g離心20 min，取上清液備用。反應體系：上清液、蒸餾水、Folin-Ciocalteu試劑及7.5 g/L的碳酸鈉溶液。充分混勻后，溶液置于30 ℃條件下水浴1 h，并于765 nm波長處測定吸光度。結果以每克鮮質量樣品所含的沒食子酸質量來表示，單位為mg/g。

DPPH自由基清除率參照de Ancos等[20]的方法測定。總酚提取液可用來測定DPPH自由基清除率，向DPPH自由基溶液中加入提取液，測定反應液在525 nm波長處的吸光度。

1.3.2.5 SOD、CAT、APX活力的測定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的測定參照Jin Peng等[21]的方法，提取液用50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.8，含1 mmol/ L EDTA和4 g/L聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP））。一個SOD活力單位為每分鐘每克鮮質量樣品的反應體系對氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）光化還原50%，單位為U/g。

過氧化氫酶（catalase，CAT）活力測定參照Cheng Hongyan等[22]的方法。提取液用50 mmol/ L的PBS（pH 7.0，含4 g/L PVP）。反應體系：pH 7.0 50 mmol/L PBS、體積分數0.75% H2O2和酶液，以每毫克鮮質量樣品每分鐘在240 nm波長處吸光度降低0.01為1個CAT活力單位，單位為U/mg。

抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力測定參照Xu Hongxia等[23]的方法。提取液用50 mmol/L PBS（pH 7.0，含0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L抗壞血酸、2 g/L PVP）。反應體系：50 mmol/L PBS（pH 7.0）、9 mmol/L抗壞血酸溶液、上清液、體積分數3%H2O2溶液，以每毫克鮮質量樣品每分鐘在290 nm波長處吸光度降低0.01為1個APX活力單位（U），單位為U/mg。

H2O2含量測定參照Sun Dequan等[25]的方法，單位為μmol/g，結果以鮮質量計。

1.4 數據處理

以上各項指標均取3 個平行樣，重復測定3 次。采用Excel 2010軟件進行數據處理，Origin 8.6軟件作圖，SAS軟件進行單因素方差分析，用Duncan多重比較法進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 冷激處理時間對茄子果實冷害指數和果肉色差L*值的影響

圖1 冷激處理對茄果實冷藏期間冷害指數（A）和果肉L*值（B）的影響Fig.1 Effect of cold shock treatment on chilling injury index (A) and pulp lightness (B) in eggplants during cold storage

如圖1A所示，茄子冷藏期間，隨著貯藏時間的延長，果實冷害指數不斷增加。冷激處理10、20、30 min 均能減輕茄子冷害，且這些處理組的果實冷害指數增長較為緩慢，其中冷激處理20 min對減輕茄子冷害的效果較好，貯藏15 d后的冷害指數僅為2.96，顯著低于CK組和其他處理組（P＜0.05）。40 min冷激處理對茄子果實冷害無顯著影響。

果肉色差L*值是反映茄子果肉褐變程度的直觀指標，L*值越小，表明果肉褐變程度越大，冷害越嚴重。如圖1B所示，CK組和冷激處理10、40 min組茄子果肉色差L*值在貯藏前6 d下降緩慢，在6～9 d急劇下降，

果肉出現輕微褐變，種子變黑，貯藏15 d時果肉褐變嚴重。冷激處理20、30 min的茄子果肉色差L*值12～15 d迅速下降，種子變黑，在貯藏15 d時，果肉只出現輕微褐變，且在貯藏6～15 d，果肉色差L*值都顯著高于對照組（P＜0.05）。其中在整個貯藏期間，冷激處理20 min組果肉色差L*值最高，果肉褐變程度最低。因此在后續實驗中均只研究了0 ℃冰水混合物冷激處理20 min對茄子果實冷藏期間活性氧代謝和滲透調節物質含量的影響。

2.2 20 min冷激處理對茄子冷藏期間相對電導率和MDA含量的影響

圖2 20 min冷激處理對茄子冷藏期間相對電導率（A）和MDA含量（B）的影響Fig.2 Effect of 20 min cold shock treatment on relative electric conductivity (A) and MDA content (B) in eggplants during cold storage

細胞膜透性的大小能反映細胞膜的完整性，是衡量果實冷害的重要指標之一。如圖2A所示，在整個冷藏期，冷激處理組和CK組茄子果肉相對電導率均在不斷上升，冷激處理組果肉相對電導率上升的速率更慢、幅度更小，始終顯著低于對照組（P＜0.05）。MDA作為膜脂過氧化代謝產物，它的含量能反映細胞膜被破壞的程度，也是衡量果實冷害程度的指標之一。如圖2B所示，隨著冷害的加劇，茄子采后貯藏期間MDA含量逐漸增加，冷激處理可抑制MDA含量上升的速率，在貯藏末期，冷激處理組MDA含量比CK組低12.08%。表明冷激處理能較好抑制茄子細胞膜通透性和MDA含量的增加，可有效地維持果實細胞膜結構的完整性，從而減輕果實的冷害癥狀。

2.3 20 min冷激處理對茄子冷藏期間脯氨酸含量和可溶性糖質量分數的影響

可溶性糖和脯氨酸都是植物細胞重要的滲透調節物質。如圖3A所示，茄子脯氨酸含量整體呈上升趨勢，但冷激處理組茄子脯氨酸含量在整個貯藏過程中都顯著高于CK組（P＜0.05）。CK組茄子可溶性糖質量分數整體呈上升趨勢，冷激處理組茄子可溶性糖質量分數在貯藏前3 d急劇上升，并在第12天達到了整個冷藏期的最大值，此時是CK組的1.90 倍，冷激處理組茄子可溶性糖質量分數在整個貯藏過程中都顯著高于CK組（P＜0.05）（圖3B）。

圖3 20 min冷激處理對茄子冷藏期間脯氨酸含量（A）和可溶性糖質量分數（B）的影響Fig.3 Effect of 20 min cold shock treatment on total proline content (A)and soluble sugar content (B) in eggplants during cold storage

2.4 20 min冷激處理對茄子冷藏期間總酚含量和DPPH自由基清除率的影響

圖4 20 min冷激處理對茄子冷藏期間總酚含量（A）和DPPH自由基清除率（B）的影響Fig.4 Effect of 20 min cold shock treatment on total phenol content (A)and DPPH radical scavenging capacity (B) in eggplants during cold storage

如圖4A所示，CK組茄子總酚含量在貯藏3 d后呈明顯上升趨勢。冷激處理處理組茄子總酚含量在0～9 d快速上升，9～12 d輕微下降。在整個貯藏過程中，冷激處理組茄子總酚含量始終高于CK組。如圖4B所示，CK組DPPH自由基清除率變化趨勢與總酚含量相似，整體不斷上升；冷激處理組DPPH自由基清除率在貯藏3～9 d急劇上升，并在第9天達到最大值，是貯藏第0天的1.48 倍。在整個冷藏期內，冷激處理組茄子DPPH自由基清除率始終高于對照組。

2.5 20 min冷激處理對茄子冷藏期間SOD、CAT及APX活力的影響

圖5 20 min冷激處理茄子冷藏期間SOD（A）、CAT（B）和APX（C）活力的影響Fig.5 Effect of 20 min cold shock treatment on SOD (A), CAT (B) and APX (C) activities in eggplants during cold storage

如圖5A所示，在整個貯藏期間，CK組茄子SOD活力總體呈下降趨勢，冷激處理促進貯藏前期茄子果實SOD活力的上升，抑制貯藏中后期SOD活力的下降，貯藏6 d后，冷激處理組SOD活力始終顯著高于對照組（P＜0.05）。隨著貯藏時間延長，冷激處理組和CK組果實CAT活力呈先上升后下降的趨勢，且均在貯藏6 d時達到最大值，但冷激處理組茄子CAT活力在貯藏6～9 d內一直保持較高的活力，之后才下降；在貯藏中后期，冷激處理組茄子CAT活力始終顯著高于對照組（P＜0.05）（圖5B）。CK組茄子APX活力在貯藏前中期緩慢上升，在第9天達到最大值（12.71 U/mg），隨后迅速下降；冷激處理組茄子APX活力在貯藏前期迅速上升，第6天達到最大值（15.50 U/mg ），之后緩慢下降；在整個冷藏期，冷激處理組APX活力始終保持在較高水平，且在貯藏12 d 后，與CK組差異顯著（P＜0.05）（圖5C）。上述結果表明，冷激處理可以保持細胞較高的SOD、CAT和APX等活性氧清除酶活力，從而減少活性氧的積累。

2.6 20 min冷激處理對茄子冷藏期間生成速率和H2O2含量的影響

圖6 20 min冷激處理茄子冷藏期間·生成速率（A）和H2O2含量（B）的影響Fig.6 Effect of 20 min cold shock treatment on · generation rate (A)and H2O2 content (B) in eggplants during cold storage

如圖6B所示，在冷藏期間，茄子H2O2含量總體呈現先上升后下降的趨勢。冷激處理組和CK組果實H2O2含量均在貯藏第6天達到最大值，分別為8.53 μmol/g和9.58 μmol/g，隨后冷激處理組果實H2O2含量迅速下降，CK組果實H2O2含量在9～12 d出現短暫上升。與CK組果實相比，經冷激處理的茄子在采后冷藏期間內能保持相對較低的H2O2含量，且在貯藏6 d后與CK組差異顯著（P＜0.05）。

3 討 論

不適當低溫造成的冷害是限制果蔬冷鏈流通的主要因素。前人研究表明冷激處理能提高黃瓜[10]、辣椒[11]、香蕉[12]和甘薯[13]等果蔬的抗冷性，顯著減少其低溫貯藏期間冷害的發生，延長果蔬貯藏期。本實驗結果表明，采用0 ℃的冰水混合物冷激處理20 min能顯著抑制茄子冷害和果肉褐變的發生，保持較低的冷害指數和較高的果肉色差L*值。由于冷激處理簡單易行，同時還可起到預冷的作用，因而在茄子冷鏈物流保鮮中具較好的應用前景。0 ℃的冰水混合物40 min冷激處理對減輕茄子冷害沒有明顯作用，這可能是因為冷激處理時間過長導致茄子果實發生低溫傷害。

可溶性糖和脯氨酸都是植物細胞重要的滲透調節物質，適宜濃度的可溶性糖和脯氨酸可提高細胞內溶質濃度，降低冰點，防止細胞脫水，減輕原生質因結冰而導致的細胞傷害[26-27]。此外，脯氨酸還可清除活性氧，穩定活性氧清除酶類的結構，抑制脂質過氧化，從而保護細胞膜的完整性，在提高植物低溫耐受性中起到積極的作用[26,28]。已有研究表明，采后處理可提高冷敏性果蔬游離脯氨酸和可溶性糖含量，進而增加果蔬的抗冷性[26,29]。如茉莉酸甲酯處理可提高枇杷果實冷藏期間脯氨酸及γ-氨基丁酸的含量，進而降低冷害指數[26]。NO和外源褪黑素處理可分別提高香蕉和桃果實中果糖、葡萄糖和蔗糖含量，增強果實抗冷性，減輕冷害癥狀[30-31]。在本研究中，茄子果實脯氨酸含量在冷藏期間呈上升趨勢，這可能是機體對低溫脅迫的應激反應，冷激處理可促進茄子可溶性糖和脯氨酸的積累，表明冷激處理可以通過增加滲透調節物質含量進而提高茄子果實的低溫耐受性。

O2-·和H2O2為2 種主要的活性氧物質，SOD可催化O2-·歧化生成毒性較低的H2O2和無毒的O2，H2O2再被CAT、APX分解為無毒的H2O和O2，最終抑制O2-·與H2O2結合生成破壞力更強的羥自由基[32]。低溫脅迫會導致活性氧清除酶類（SOD、CAT、APX）活力下降，誘導植物產生大量活性氧，高濃度的活性氧會加劇膜脂的過氧化作用，破壞生物膜的結構和功能，增加液泡中多酚類物質與質體中多酚氧化酶接觸的機會，從而引發組織褐變等冷害癥狀[33-34]]。前人研究表明，冷激處理可提高番茄與黃瓜果實CAT、APX、POD的活力，降低了果實的冷害發生率[35-36]。Liu Dongjie等[37]報道亞精胺和冰溫處理可以提高青椒果實SOD活力，提高果實抗冷性。Cao Shifeng等[38]發現茉莉酸甲酯處理可提高冷藏期間枇杷果實活性氧清除酶的活力，減少活性氧的積累，抑制膜脂的過氧化作用，維持較低的細胞膜透性，進而減輕果實褐變等冷害癥狀。本研究發現，隨著冷害程度的加重，CK組SOD活力呈不斷下降趨勢，CAT和APX活力在貯藏前期上升，貯藏后期下降，且O2-·產生量和冷藏前期H2O2含量的不斷增加，誘發了膜脂的過氧化作用，破壞生物膜的結構和功能，使細胞膜透性及MDA含量處在較高水平，導致果實褐變，最終加劇了茄子冷害的癥狀。而冷激處理抑制了茄子低溫貯藏過程中SOD活力的下降，促進茄子冷藏前期CAT及APX活力的上升，并延緩了貯藏中后期CAT、APX活力的下降，抑制了活性氧的積累，降低了膜脂過氧化產物MDA含量和相對電導率，減緩了果肉色差L*值的下降。以上結果表明，冷激處理可維持茄子果實活性氧代謝的平衡，抑制低溫誘導的活性氧對膜脂的過氧化作用，從而維持膜結構的完整性，抑制果實褐變程度，進而延緩茄子果實冷害的發生。

4 結 論

0 ℃冰水20 min冷激處理可顯著降低茄子果實在4 ℃貯藏時的冷害指數和果肉褐變，減輕冷害發生。冷激處理可保持茄子果實在冷藏過程中較高的SOD、APX和CAT等抗氧化酶活力和總酚含量，提高果實的抗氧化活力，維持果實活性氧代謝平衡，抑制膜脂過氧化作用，保護膜結構的完整性，進而延緩茄子果實冷害的發生。冷激處理可提高冷藏過程中茄子果實滲透調節物質可溶性糖質量分數和脯氨酸含量，從而提高果實抗冷性，延緩冷害發生。