過氧化物酶體增殖物激活受體α在對乙酰氨基酚肝損傷的研究進展

張真真,曲愛娟,王艷

(1.北京大學第一醫院感染疾病科，北京 100034；2.首都醫科大學基礎醫學院 生理學與病理生理學系，重塑相關心血管疾病教育部重點實驗室，北京 100069)

對乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)是一種常見的解熱鎮痛藥物，正常劑量情況下發揮解熱鎮痛作用，然而APAP過量時常常引起急性肝損傷甚至誘導肝衰竭，死亡率較高。1966年，Davidson等首次報道了2例由于APAP引起肝壞死的病例[1]。1973年Mitchell等通過APAP動物模型系列研究APAP肝損傷機制，表明APAP經過I相代謝酶細胞色素P450 酶代謝形成活性產物N-乙酰基-對-苯醌亞胺(N-acetyl-p-benzoquinone imine,NAPQI)，谷胱甘肽(glutathion,GSH)耗竭，NAPQI蓄積與大分子蛋白質結合形成共價化合物，從而造成肝細胞損傷，也稱為代謝階段損傷[2]。2005年Reid等研究表明APAP誘導的肝損傷不僅引起代謝階段損傷，進一步引起肝細胞內線粒體損傷，氧化應激形成[3]，隨后大量研究表明APAP經過代謝階段以及氧化應激階段兩次打擊學說以后觸發多條信號通路，最終引起肝細胞損傷[4-5]。其中過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor alpha,PPARα)是核受體超家族成員之一，參與肝臟代謝酶的調節，本文將綜述PPARα在APAP肝損傷的作用機制以及研究進展。

1 APAP肝損傷的發病機制

過量的APAP引起肝損傷在體內經歷兩次打擊學說(代謝損傷以及氧化應激引起的損傷放大)。造成肝細胞壞死，釋放損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)，最終引起肝內無菌性炎癥反應，對肝損傷和修復發揮雙重調節作用。

1.1APAP的代謝治療劑量APAP大多數通過肝內Ⅱ相代謝酶UDP-葡萄糖醛酸轉移酶(UDP-glucuronosyltrans-ferase,UGT)和磺基轉移酶(sulfotransferase,SULT)轉化為無毒的葡萄糖醛酸鹽或硫酸鹽從腎臟排泄，其中UGT酶包括UGT1A1，UGT1A6，SULT酶包括SULT1A1，SULT1A3/3，SULT1E1，少部分通過I相代謝酶細胞色素P450酶系(主要為CYP2E1)轉化為活性代謝產物NAPQI,NAPQI隨后在谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathione S-transferase,GST)的作用下與肝內GSH結合，轉化為無毒的APAP-GSH，從膽汁排泄；當APAP過量時，將引起NAPQI在體內蓄積，GSH耗竭，過多的NAPQI與肝細胞線粒體內大分子蛋白質共價結合，形成蛋白質共價化合物，抑制線粒體氧化呼吸，引起線粒體氧化應激，活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生，造成線粒體第一次打擊[6]。

1.2線粒體氧化應激引起損傷放大APAP代謝損傷僅占很小一部分，當活性代謝產物NAPQI與線粒體大分子蛋白質結合，引起線粒體氧化應激，ROS產生，激活腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK]信號通路，早期(0～2 h)引起糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)以及MAP3k混合譜系酶3(mixed lineage kinase 3,MLK3)的激活，而在晚期(2～4 h)則促進凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1,ASK1)激活，兩者均能引起絲裂原活化蛋白激酶激酶4/7 (mitogen-activated protein kinase Kinases 4/7,MKK4/7) 激活，最終引起c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK) 磷酸化，磷酸化的JNK與線粒體外膜蛋白Sab結合，進一步抑制線粒體氧化呼吸，引起第二次打擊，ROS持續產生，最終引起線粒體膜通透性孔開放(mitochondria permeability transition,MPT)，膜勢能下降，繼而肝細胞壞死[4]。

1.3肝細胞壞死APAP引起的肝細胞壞死主要為程序性壞死，程序性壞死是受體相互作用蛋白(receptor interacting protein,RIP)家族所介導的，RIP1和RIP3相互結合，促進細胞由凋亡轉換至壞死，引起細胞程序性壞死[7]。有研究表明RIPK1[8]以及RIPK3[9]參與APAP誘導的肝壞死，同時研究表明APAP通過活化RIPK1進一步激活JNK引起肝細胞壞死[8]，然而RIPK1通過什么機制激活JNK并不清楚，并且RIPK1以及RIPK3是否參與APAP肝損傷目前仍然存在爭議[8-9]。

1.4無菌性炎癥壞死的肝細胞釋放DAMP，包括高遷移率族蛋白1 (high mobility group box-1 protein,HMGB1)、核DNA、熱休克蛋白(heat shock protein,HSPs)、角蛋白18(keratin 18,K18)，激活先天固有免疫系統，引起肝內無菌性炎癥反應，釋放細胞因子和趨化因子，趨化單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞到達損傷部位，加重損傷并促進再生修復[10-11]。而炎癥小體在APAP肝損傷的作用機制目前還存在爭議[12]，尚需進一步研究。

2 PPARα在APAP肝損傷的作用

PPARα是配體激活的核受體，在代謝調節方面發揮重要的作用。PPARα主要表達于脂肪酸氧化代謝速率較高的組織如肝臟、心臟、骨骼肌、棕色脂肪組織以及腎臟，也可表達于免疫細胞如單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞。PPARα調節脂代謝相關基因的表達，促進脂肪酸氧化，維持脂代謝平衡[13]；并具有抗炎和抗增殖效應[14]。臨床上PPARα激動劑用于治療高三酰甘油血癥和低密度脂蛋白膽固醇的血脂異常[15]。

2.1PPARα并不參與調節APAP肝臟代謝活化

利用PPARα激動劑研究證實PPARα促進多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance-associated protein)Mrp3和Mrp4的表達從而保護APAP肝損傷，但并不影響APAP代謝，NAD(P)H:醌氧還酶1 (NQO1)、NAPQI以及UGT酶的活性均無顯著改變[16]。PPARα全基因敲除小鼠動物實驗的結果亦證實PPARα并不通過影響APAP代謝活化而保護肝臟[17]。

2.2PPARα是否通過磷酸化參與調節APAP誘導的氧化應激尚需驗證通過液相色譜質譜技術(liquid chromatograph mass Spectrometer,LC-MS)代謝組學研究以及動物實驗結果證實PPARα通過誘導靶基因線粒體解偶聯蛋白2 (Uncoupling protein 2,UCP2)的表達，降低JNK，c-jun、H2O2的水平，同時增加線粒體GSH水平，進而抑制APAP誘導的線粒體脂肪酸β氧化即氧化應激水平，從而保護肝細胞[18]。但也有其他機制研究結果顯示APAP模型抗氧化基因的表達下調，氧化應激增加，但PPARα及其靶基因Angptl4以及Mcad的表達沒有變化[19]。以上研究結果并不統一，PPARα在蛋白水平如何調節APAP肝損傷亦需進一步研究證實。

PPARα蛋白活性受磷酸化調節，而ERK、p38-MAPK、PKA、PKC以及GSK3等均可調節PPARα磷酸化[20]。研究表明在APAP肝損傷中，NAPQI誘導早期氧化應激，激活GSK3β以及MLK3，隨后通過MKK4/7激活JNK，激活的 pJNK隨后轉位入線粒體，引起線粒體膜通透性轉換MPT，線粒體外膜腫脹裂解，促進凋亡誘導因子AIF以及EndoG釋放，隨后EndoG入核，促進肝損傷[21-22]。2016年Christian Trautwein等[23]證實在小鼠和人類急性及慢性毒性肝損傷模型以及小鼠APAP誘導急性肝損傷模型(APAP 500 mg·kg-1,IP,8h)中，肝細胞中JNK1和JNK2聯合作用，通過JNK-JunD依賴性通路、MAPK通路保護肝損傷。但是否上述激酶通過磷酸化PPARα發揮作用以及PPARα是否通過抑制線粒體氧化應激干擾線粒體膜勢能，從而干擾JNK1以及JNK2的作用，最終調節APAP肝損傷仍舊需要進一步研究來闡明。

2.3PPARα是否參與調節APAP肝臟炎癥尚無定論炎癥細胞明確參與了APAP肝炎癥損傷過程，但炎癥細胞中表達的PPARα是否參與APAP損傷過程目前尚不清楚。Holland,Ricky D等采用基因表達譜分析方法證實Vanin1在APAP誘導的肝臟炎癥中發揮重要作用[24]。隨后有研究發現Vanin1敲除C57BL/6鼠肝細胞增殖減少(PCNA陽性肝細胞減少)，F4/80陽性巨噬細胞浸潤減少和異常分布，同時炎癥細胞因子TNF-α、CCl2、iNOS以及IL-4的表達降低，肝臟局部Gr1以及CD11b陽性的炎性細胞減少，從而壞死細胞清除減少，APAP肝損傷加重。但是Vanin1對GSH含量、APAP代謝酶以及APAP生物解毒并沒有影響[25]。因此，Vanin1與炎癥細胞中表達的PPARα是否相關、PPARα是否參與APAP誘導的肝臟炎癥反應尚無定論。

2.4PPARα參與APAP肝損傷晚期再生修復研究表明PPARα敲除鼠給予PHx手術后肝再生延遲，同時PPARα可以增加細胞增殖以及降低凋亡，促進肝再生[26-27]，有助于損傷肝組織的修復。非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)小鼠APAP肝損傷模型研究結果也顯示NASH小鼠通過降低細胞分裂和組織修復，下調PPARα的表達從而促進APAP肝損傷；給予非諾貝特飲食后減輕APAP肝損傷，說明PPARα通過促進肝再生從而減輕NASH小鼠APAP肝損傷[28]。美國路易斯安那大學藥理毒理學系Mehendale,HM等于2003年在鏈脲霉素糖尿病鼠(STZ-DB)模型中也發現PPARα敲除小鼠的肝臟S期DNA合成以及PCNA水平明顯降低，說明其肝組織再生能力減弱。進一步的基因芯片分析表明與PPARα null-DB鼠相比，WT-DB鼠細胞氧化/應激/DNA損傷基因Gadd45、GADD153、EGR1、HO-1水平明顯下調，促進APAP排泄的P450酶基因Cyp4a10,4a14上調。CyclinD1、 p38 MAPK、Cdk6的表達上調，NF-κB明顯激活，提示PPARα亦可能在參與干細胞再生修復的同時還參與轉錄后水平的調節[29]。

既往大量研究證實P38應激激活蛋白激酶參與調節細胞生長、分化、增殖、凋亡以及炎癥和應激反應；而P38可以磷酸化PPARα A/B結構域中的Ser 6，12和/或21，活化PPARα；動物實驗結果顯示PPARα敲除小鼠檢測p38 MAPK表達降低[30]。但是否APAP通過下調P38 AMPK，從而抑制PPARα磷酸化，抑制細胞增殖，促進肝損傷仍需要進一步研究。PPARα調節APAP肝再生的具體機制尚不十分清楚。

3 總結與展望

PPARα是關鍵的代謝調控因子，在轉錄水平作為核受體轉錄因子，具有調節脂肪酸代謝、細胞周期及炎癥基因表達的作用，在蛋白水平還可受磷酸化調節。由于目前應用的是PPARα全基因敲除小鼠模型，可能存在機體脂質代謝紊亂繼發氧化應激的混雜因素存在，影響研究結果的準確性，也造成目前相關研究結果不一致的原因之一。另外，由于PPARα激動劑非諾貝特可引起急性以及持續的血肌酐水平的升高，且藥物蓄積引起肌病的風險較高，臨床需要更安全的靶向PPARα的藥物研發。未來希望能夠采用細胞特異性PPARα敲除模型，明確PPARα對于APAP肝損傷的特異性作用機制，幫助研發有效的靶向藥物，挽救并逆轉臨床藥物性肝損傷患者疾病進程。