氨肽酶N/CD13在骨肉瘤細胞中的作用

謝惠敏，王碩，宋光澤，張增亮，李南，吳朝倩解放軍總醫院康復醫學中心，北京00039

2解放軍總醫院第一附屬醫院骨腫瘤中心，北京1000483浙江普洛康裕制藥有限公司，浙江 東陽322118

骨肉瘤是最常見的惡性骨腫瘤之一，多發生于10～30歲的人群[1-3]。骨肉瘤主要發生于長骨，其中大約一半發生于膝關節和肱骨[4]。最受影響的部位是股骨、脛骨、肱骨，而很少發生于肩胛骨、骨盆骨和顱骨[5]。大約有20%的骨肉瘤患者在初次診斷時就已經出現肺轉移，其中40%的肺轉移患者在發現時已經是疾病晚期；80%的轉移出現在肺部，導致周圍型肺癌，對于該部分患者，化療效果不佳[6-9]。發生轉移的骨肉瘤患者的5年生存率僅為20%，而未發生轉移患者的5年生存率為65%[10-11]。近年來通過術前新輔助化療，可以減少骨肉瘤患者的截肢風險，但并未提高治療效果[12-13]。因此，尋找一種可以預測預后的分子標志物以及潛在的治療靶點，已成為骨肉瘤研究的熱點。

氨肽酶N，也稱CD13，是一種Zn+依賴性的膜結合金屬蛋白酶，在腎臟、小腸、肝臟和中樞神經系統中分布廣泛，同時參與了營養素的最終水解以及腦啡肽和內啡肽等生物活性分子的降解[14]。由于許多腫瘤細胞表面的CD13都呈現高表達，因此，CD13可以作為一種腫瘤標志物[15]。CD13在惡性腫瘤細胞的生長、侵襲等過程中發揮關鍵作用，可能成為一種潛在的抗腫瘤治療靶點。惡性腫瘤的基本特征是無限生長、浸潤和轉移，涉及腫瘤細胞的粘連、酶降解、趨化、基質內血管增生等一系列過程。有研究表明，雖然很多因素可以影響腫瘤的發展，但加重腫瘤惡化的重要因素是腫瘤細胞及其微環境中的蛋白降解酶[16]。氨肽酶是一種從肽鏈N端或蛋白質中催化水解肽鍵的水解酶，在蛋白質的降解過程中發揮著至關重要的作用。有研究表明，氨肽酶N，又稱丙氨酰氨肽酶，與細胞表面的CD13抗原是同一蛋白[17]，它參與腫瘤細胞對血管壁的穿透及對細胞基質和基底膜的浸入等過程[18]。文獻指出，CD13與腫瘤的生長及異常血管的生成密切相關，甚至還能促進腫瘤細胞的增殖和分化[19-22]。CD13還可以通過分解白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和胸腺肽導致免疫力下降[23]。研究表明，通過抑制CD13分子可以阻止腫瘤細胞的侵襲和轉移，CD13可能成為腫瘤治療的新靶點[24]。

在人體的多種細胞表面都有CD13的表達，如中樞神經系統突觸細胞[25]、活化的內皮細胞、肝細胞、肺泡上皮細胞、腎近曲小管上皮細胞、破骨細胞以及惡性黑色素瘤細胞等，并且在腎臟和腸刷狀緣細胞中大量富集[26-27]。Liotta等[28]提出“三階段”學說——黏附、降解和運動，他們認為腫瘤細胞黏附是指由于原發腫瘤細胞的增殖，腫瘤細胞從原發灶脫落并靠近細胞基底膜，再通過細胞表面的受體與細胞基底膜或細胞外基質成分相結合的過程。降解是指腫瘤細胞通過分泌或者利用細胞膜上存在的多種蛋白酶降解細胞基底膜或細胞外基質蛋白的過程。運動是指腫瘤細胞通過降解的基底膜或細胞外基質間隙進行定向運動、游走并向遠處轉移，進入血管和淋巴管，隨血液或淋巴液轉移至全身的過程。腫瘤細胞就是按照上述3個階段，由原發腫瘤進展成為轉移性腫瘤。Zhang等[29]研究表明，CD13在骨腫瘤細胞的發展過程中發揮了重要作用，促進了骨腫瘤細胞的增殖、浸潤及轉移，但并未詳細闡述其機制。根據目前的研究，骨肉瘤細胞中的CD13主要有以下作用。

1 CD13加速骨肉瘤細胞的增殖并抑制其凋亡

腫瘤的發生、發展與細胞過度增殖和凋亡失控有關。大多數腫瘤的出現是由細胞凋亡失控、組織無限增長所致。因此，通過誘導細胞凋亡可以阻止腫瘤細胞過度增殖。在體外狀態下，應用CD13單克隆抗體或CD13抑制劑能有效降低單核細胞的增殖率。Mishima等[30]研究報道，CD13大量表達的腫瘤細胞株與內皮細胞混合，可以使內皮源性白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）誘導的凋亡停止，而在應用CD13抑制劑后該作用消失，驗證了CD13具有抑制腫瘤細胞凋亡的作用。van Hensbergen等[31]研究發現，CD13的活性與腫瘤負荷呈正相關，在骨肉瘤、肺癌、腸癌等實體瘤中，腫瘤體積與CD13的活性呈正相關。Wang等[32]的研究進一步證明，CD13與腫瘤分期及腫瘤體積呈正相關，并影響患者的生存期。

2 CD13促進骨肉瘤血管的形成

骨肉瘤好發于長骨的干骺端，由于其血運豐富，易出現血行轉移。腫瘤血管與正常血管相比，不僅多，而且通透性大，使得腫瘤細胞的增殖和侵襲非常迅速。在一些研究中，新生的血管內皮細胞提示有CD13的增加但并未發現成熟的血管，說明CD13可能是新生腫瘤血管的調節因子[33-35]。Fukasawa等[36]研究發現，血管內皮細胞中CD13的表達與細胞轉移、黏附和血管形成能力均成正比。陳倩竹等[37]研究發現，骨肉瘤中CD13的表達與血管內皮細胞的遷移及血管形成能力成正比。

3 C D13促進骨肉瘤細胞的增殖、浸潤和轉移

CD13可以通過降解免疫活性物質（如胸腺肽和白細胞介素等），使機體的免疫力降低，腫瘤細胞的轉移速度加快[29]。Saiki等[38]研究發現，CD13在腫瘤表面過度表達，加速了腫瘤細胞的轉移。CD13還可以通過降低IL-8、主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ型黏附抗原決定簇的表達，從而降低T細胞對腫瘤細胞的識別[39]。Kido等[40]研究發現，白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）可以促進腫瘤細胞的轉移，并可被CD13的抑制劑苯丁抑制素抑制。說明在人類骨腫瘤細胞中，IL-6信號通路在CD13的監管和入侵中扮演著重要的角色。Liang等[41]通過研究進一步發現，上述作用與激活MAPK、PI3K信號通路，激活轉錄因子NF-κB，誘導靶基因MMP-2和MMP-9的表達相關。

4 CD13對骨肉瘤侵襲及預后的影響

Zhang等[29]研究發現，CD13可以增強骨肉瘤細胞的黏附性，提高其降解基底膜的能力。Saiki等[39]研究發現，CD13可以介導黑色素瘤的轉移，原因可能是CD13可以促進腫瘤細胞的黏附以及細胞外基質蛋白的降解。同樣Kido等[42]研究也發現，由于CD13可以促進腫瘤細胞的黏附，其在骨肉瘤的轉移中發揮著重要作用。CD13還具有蛋白水解酶的作用，可以降解細胞間基質，促進脫落的腫瘤細胞向基底膜侵襲[29]；CD13通過多種機制發揮多種功能，包括酶的裂解、內吞作用和信號轉導[43-44]。CD13的表達可以提高惡性腫瘤細胞的侵襲能力，這與CD13的活性有關。然而，有關CD13在骨肉瘤中的表達及其與預后的關系，國內外相關研究不多。Wang等[32]研究發現，骨肉瘤患者中CD13陽性的患者傾向于高死亡率，這意味著CD13陽性患者的預后不良。Sanz等[45]對結直腸癌患者進行術后隨訪，結果發現血漿CD13含量較高的患者5年生存率較低。Yamanaka等[46]研究發現，CD13含量較多的肝細胞性肝癌患者的早期復發率較高，且預后較差。此外，在B型淋巴細胞白血病、非小細胞肺癌、胃癌患者中，CD13的表達均與預后呈負相關[47-49]。陳平鋒[50]的研究發現，CD13表達與腎癌的分化程度、淋巴結轉移情況及TNM分期等臨床因素有關（P＜0.05）；K-M生存曲線提示，CD13陽性表達的患者較陰性表達患者的生存率低（P＜0.05）；多因素Cox逐步回歸分析提示，CD13是影響患者總生存率的獨立危險因素。

對于骨肉瘤患者，臨床上主要采取手術治療，而晚期的骨肉瘤患者多采用姑息性放化療，但總體療效欠佳。因此，在骨肉瘤的治療中，尋找新的治療靶點及腫瘤標志物是未來研究的熱點。近幾年來，新輔助化療方案及用藥具有一定的局限性，在提高患者生存率、生活質量及預后上未有太多的突破。因此，尋找新的分子標志物預測骨肉瘤的預后，尋找有效的基因靶點，開展有效的靶向治療成為未來骨肉瘤研究的熱點。文獻報道，CD13特異性抑制劑的代表藥物烏苯美司（Ubenimex）在抗腫瘤治療中取得了良好的效果，烏苯美司聯合放化療能夠有效提高晚期非小細胞肺癌患者的免疫功能，可作為化療的輔助性用藥[51]。Christ等[52]研究也發現，烏苯美司具有誘發肝癌細胞凋亡的能力。

研究表明，對于多發性骨髓瘤患者，在沙利度胺+馬法蘭+強的松（TMP）化療的基礎上加用烏苯美司，可提高患者的緩解程度，延長無進展生存期，降低骨髓抑制的發生率及不良反應的程度[53]。李煒等[54]研究指出，與單用替吉奧聯合奧沙利鉑（SOX）方案相比，烏苯美司聯合SOX化療方案治療晚期胃癌的效果顯著，可有效改善患者的免疫功能，提高遠期生存率，且安全性更高。

5 小結

近年來，基因治療和分子靶向治療在腫瘤領域取得了長足發展，抗血管生成藥物及腫瘤免疫治療在骨腫瘤領域的應用顯示出了較好的前景，針對CD13在骨腫瘤領域的靶向治療亦顯示出了初步的治療效果，但仍有待于臨床進一步研究。

[1]Meyers PA,Gorlick R.Osteosarcoma[J].Pediatr Clin North Am,1997,44(4):973-989.

[2]Moore DD,Luu HH.Osteosarcoma[J].Cancer Treat Res,2014,162:65-92.

[3]Bielack SS,Bernstein ML.Cancer in children:clinical management[M].5th.New York:Oxford University Press,2005.

[4]Mankin HJ,Mankin CJ,Simon MA.The hazards of the biopsy,revisited.Members of the musculoskeletal tumor society[J].J Bone Joint Surg Am,1996,78(5):656-663.

[5]Joerger M,Huober J.Diagnostic and prognostic use of bone turnover markers[J].Recent Results Cancer Res,2012,192:197-223.

[6]Harting MT,Blakely ML.Management of osteosarcoma pulmonary metastases[J].Semin Pediatr Surg,2006,15(1):25-29.

[7]Bacci G,Rocca M,Salone M,et al.High grade osteosarcoma of the extremities with lung metastases at presentation:treatment with neoadjuvant chemotherapy and simultaneous resection of primary and metastatic lesions[J].J Surg Oncol,2008,98(6):415-420.

[8]Messerschmitt PJ,Garcia RM,Abdul-Karim FW,et al.Osteosarcoma[J].J Am Acad Orthop Surg,2009,17(8):515-527.

[9]PosthumaDeBoer J,Witlox MA,Kaspers GJ,et al.Molecular alterations as target for therapy in metastatic osteosarcoma:a review of literature[J].Clin Exp Metastasis,2011,28(5):493-503.

[10]Eccles SA,Welch DR.Metastasis:recent discoveries and novel treatment strategies[J].Lancet,2007,369(9574):1742-1757.

[11]Pradelli E,Karimdjee-Soilihi B,Michiels JF,et al.Antagonism of chemokine receptor CXCR3 inhibits osteosarcoma metastasis to lungs[J].Int J Cancer,2009,125(11):2586-2594.

[12]李海亮,胡宇賢,南囡.骨肉瘤新輔助化療結合保肢手術的臨床療效相關因素分析[J].山西醫藥雜志,2017,46(5):545-548.

[13]杜敏東,易生輝,秦剛,等.新輔助化療結合保肢手術治療骨肉瘤26例[J].中國醫藥導報,2017,14(29):7-10.

[14]Antczak C,De Meester I,Bauvois B.Ectopeptidases in pathophysiology[J].Bioessays,2001,23(3):251-260.

[15]徐文方.以氨肽酶N/CD13為靶點的抗癌藥物研究[A].中國工程院醫藥衛生學部、中國抗癌協會抗癌藥物專業委員會、中國藥理學會腫瘤藥理專業委員會[C].2007醫學前沿論壇暨第十屆全國腫瘤藥理與化療學術會議論文集,2007:1.

[16]Ishii K,Usui S,Sugimura Y,et al.Aminopeptidase N regulated by zinc in human prostate paiticipates in tumor cell invasion[J].Int J Cancer,2001,92(1):49-54.

[17]Taylor A.Aminopeptidases:towards a mechanism of action[J].Trends Biochem Sci,1993,18(5):167-171.

[18]Dixon J,Kaklamanis L,Turley H,et al.Expression of aminopeptidase-N(CD13)in normal tissues and malignant neoplasms of epithelial and lymphoid origin[J].J Clin Pathol,1994,47(1):43-47.

[19]Bauvois B,Dauzonne D.Aminopeptidase-N/CD13(EC 3.4.11.2)inhibitors:chemistry,biological evaluations,and therapeuticprospects[J].MedResRev,2006,26(1):88-130.

[20]Shim JS,Kim JH,Cho HY,et al.Irreversible inhibition of CD13/aminopeptidase N by the antiangiogenic agent curcumin[J].Chem Biol,2003,10(8):695-704.

[21]Bhagwat SV,Lahdenranta J,Giordano R,et al.CD13/APN is activated by angiogenic signals and is essential for capillary tube formation[J].Blood,2001,97(3):652-659.

[22]Pasqualini R,Koivunen E,Kain R,et al.Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogenesis[J].Cancer Res,2000,60(3):722-727.

[23]Kanayama N,Kajiwara Y,Goto J,et al.Inactivation of interleukin-8 by aminopeptidase N(CD13)[J].J Leukoc Biol,1995,57(1):129-134.

[24]Wickstr?m M,Larsson R,Nygren P,et al.Aminopeptidase N(CD13)as a target for cancer chemotherapy[J].Cancer Sci,2011,102(3):501-508.

[25]Alliot F,Rutin J,Leenen PJ,et al.Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N,aminopeptidase A,and nestin[J].J Neurosci Res,1999,58(3):367-378.

[26]Breljak D,Gabrilovac J,Borani? M.Aminopeptidase N/CD13 and haematopoietic cells[J].Haema,2003,6(4):453-461.

[27]施思,廖曉龍.CD13/APN生物學功能的研究進展[J].國外醫學(輸血及血液學分冊),2005,28(6):504-507.

[28]Liotta LA,Steeg PS,Stetler-Stevenson WG.Cancer metastasis and angiogenesis:an imbalance of positive and negative regulation[J].Cell,1991,64(2):327-336.

[29]Zhang X,Zhang J,Zhang L,et al.Design,synthesis and biological evaluation of novel 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid derivatives as aminopeptidase N/CD13 inhibitors[J].Bioorg Med Chem,2011,19(20):6015-6025.

[30]Mishima Y,Matsumoto-Mishima Y,Terui Y,et al.Leukemic cell-surface CD13/aminopeptidase N and resistance to apoptosis mediated by endothelial cells[J].J Natl Cancer Inst,2002,94(13):1020-1028.

[31]van Hensbergen Y,Broxterman HJ,Hanemaaijer R,et al.Soluble aminopeptidase N/CD13 in malignant and nonmalignant effusions and intratumoral fluid[J].Clin Cancer Res,2002,8(12):3747-3754.

[32]Wang S,Xie H,Wei X,et al.Relation between the expression of aminopeptidase N(APN)/CD13 and the clinical significance in osteosarcomas[J].Int J Clin Exp Med,2016,9(11):22034-22040.

[33]Bhagwat SV,Petrovic N,Okamoto Y,et al.The angiogenic regulator CD13/APN is a transcriptional target of Ras signaling pathwaysin endothelialmorphogenesis[J].Blood,2003,101(5):1818-1826.

[34]Aozuka Y,Koizumi K,Saitoh Y,et al.Anti-tumor angiogenesis effect of aminopeptidase inhibitor bestatin against B16-BL6 melanoma cells orthotopically implanted into syngeneic mice[J].Cancer Lett,2004,216(1):35-42.

[35]Ikeda N,Nakajima Y,Tokuhara T,et al.Clinical significance of aminopeptidase N/CD13 expression in human pancreatic carcinoma[J].Clin Cancer Res,2003,9(4):1503-1508.

[36]Fukasawa K,Fujii H,Saitoh Y,et al.Aminopeptidase N(APN/CD13)is selectively expressed in vascular endothelial cells and plays multiple roles in angiogenesis[J].Cancer Lett,2006,243(1):135-143.

[37]陳倩竹,馬磊,蔣師放,等.下調骨肉瘤細胞CD13表達對腫瘤血管生成的作用及機制[J].中國細胞生物學學報,2017,39(5):551-557.

[38]Saiki I,Fujii H,Yoneda J,et al.Role of aminopeptidase N(CD13)in tumor-cell invasion and extracellular matrix degradation[J].Int J Cancer,1993,54(1):137-143.

[39]Ferrer L,Fondevila D,Rabanal R,et al.Immunohistochemical detection of CD3 antigen(pan T marker)in canine lymphomas[J].J Vet Diagn Invest,1993,5(4):616-620.

[40]Kido A,Krueger S,Haeckel C,et al.Possible contribution of aminopeptidase N(APN/CD13)to invasive potential enhanced by interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptor in human osteosarcoma cell lines[J].Clin Exp Metastasis,1999,17(10):857-863.

[41]Liang W,Gao B,Xu G,et al.Possible contribution of aminopeptidase N(APN/CD13)to migration and invasion of human osteosarcoma cell lines[J].Int J Oncol,2014,45(6):2475-2485.

[42]Kido A,Krueger S,Haeckel C,et al.Inhibitory effect of antisense aminopeptidase N(APN/CD13)cDNA transfection on the invasive potential of osteosarcoma cells[J].Clin Exp Metastasis,2003,20(7):585-592.

[43]Mina-Osorio P.The moonlighting enzyme CD13:old and new functions to target[J].Trends Mol Med,2008,14(8):361-371.

[44]Liao CL,Lai KC,Huang AC,et al.Gallic acid inhibits migration and invasion in human osteosarcoma U-2 OS cells through suppressing the matrix metalloproteinase-2/-9,protein kinase B(PKB)and PKC signaling pathways[J].Food Chem Toxicol,2012,50(5):1734-1740.

[45]Sanz B,Perez I,Beitia M,et al.Aminopeptidase N activity predicts 5-year survival in colorectal cancer patients[J].J Investig Med,2015,63(5):740-746.

[46]Yamanaka C,Wada H,Eguchi H,et al.Clinical significance of CD13 and epithelial mesenchymal transition(EMT)markers in hepatocellular carcinoma[J].Jpn J Clin Oncol,2018,48(1):52-60.

[47]Saxena A,Rai A,Raina V,et al.Expression of CD13/aminopeptidase N in precursor B-cell leukemia:role in growth regulation of B cells[J].Cancer Immunol Immunother,2010,59(1):125-135.

[48]Tokuhara T,Hattori N,Ishida H,et al.Clinical significance of aminopeptidase N in non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res,2006,12(13):3971-3978.

[49]Nohara S,Kato K,Fujiwara D,et al.Aminopeptidase N(APN/CD13)asatargetmoleculeforscirrhousgastriccancer[J].ClinResHepatolGastroenterol,2016,40(4):494-503.

[50]陳平鋒.氨基肽酶N在腎細胞癌組織的表達及意義[J].中國現代醫學雜志,2015,25(15):29-33.

[51]雷培森,王建忠,師瑞,等.烏苯美司聯合放化療對晚期肺癌免疫功能的影響[J].現代生物醫學進展,2017,17(22):4307-4310.

[52]Christ B,Stock P,Dollinger MM.CD13:waving the flag for a novel cancer stem cell target[J].Hepatology,2011,53(4):1388-1390.

[53]張家友,吳亞兵,劉軍慧,等.烏苯美司聯合TMP方案治療多發性骨髓瘤的療效觀察[J].腫瘤藥學,2017,7(3):328-331;359.

[54]李煒,姚忠強,柳仲秋,等.烏苯美司膠囊聯合SOX化療對晚期胃癌患者的臨床療效研究[J].現代生物醫學進展,2017,17(23):4495-4497;4470.