circRNA-miRNA軸在腫瘤中的研究進展△

霍佳寧，馬曉欣

中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004

自非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）成為研究熱點以來，其對腫瘤發生、發展的重要性逐漸被認識。繼微小RNA（microRNA，miRNA）與長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）之后，環狀RNA（circular RNA，circRNA）成為新的研究熱點。circRNA是一類特殊的ncRNA，其最早在仙臺病毒中被發現，它區別于傳統的線性RNA，是一類新型的RNA，具有特殊的閉合環狀結構，因此，circRNA不易降解，在多種生物體內穩定表達，更適合作為腫瘤診斷與治療的靶點[1-2]。miRNA是在多種真核細胞和病毒中發現的一類內源性lncRNA，長度為22～28 nt，在進化方面具有保守性。miRNA在多種腫瘤中以癌基因或抑癌基因的方式發揮作用，因而與腫瘤的關系十分密切[3]。越來越多的研究表明，circRNA可以與miRNA結合影響腫瘤的生物學行為，針對circRNA-miRNA軸的研究正在被不斷豐富，本文旨在綜述circRNA-miRNA軸在腫瘤中的研究進展及其對腫瘤診斷與治療的可能應用。

1 circRNA的形成及其功能

circRNA根據序列的形成和組合方式的不同分為3種類型：外顯子來源的circRNA（exonic circRNA，ecircRNA）、內含子來源的circRNA（circular intronic RNA，ciRNA）、外顯子-內含子 circRNA（exonic-intronic circRNA，EIciRNA）。目前發現的80%的circRNA為ecircRNA，ecircRNA的形成機制主要通過兩種途徑：套索驅動環化和內含子配對驅動環化。ciRNA主要通過自我剪接內含子形成。EIciRNA的形成機制目前尚未研究清楚。

目前發現的circRNA的功能主要包括以下幾個方面：①作為miRNA海綿競爭性結合miRNA的結合位點，使miRNA失去其自身功能及對下游靶基因的調節功能。②調節基因轉錄，EIciRNA通過與基因轉錄起始位點上游300 bp的RNA聚合酶Ⅱ相互作用來增強基因的轉錄功能和調節基因的表達；同時，拼接因子MBL的第2個外顯子可以環化形成circRNA，影響線性RNA的形成，以調節基因的表達。③與蛋白質相互作用，miRNA效應器Argonaute（AGO）可以通過與circRNA等結合而降解。同時，circRNA通過與蛋白質相互作用參與調節細胞的多種生理過程。④參與蛋白質翻譯，大多數circRNA為ecircRNA，主要存在于細胞質中，因此，可以裝載至核糖體中，并翻譯成多肽。

2 miRNA的海綿作用

一些具有相同miRNA應答元件的RNA可以競爭性結合miRNA位點來影響miRNA對其靶基因的作用，從而影響腫瘤的生物學行為，稱為miRNA的“海綿作用”（miRNA sponge）。目前有研究表明，circRNA也能夠競爭性結合miRNA位點，影響miRNA及下游靶基因的表達。circRNA通過應答元件與miRNA相互關聯后，既可以作為腫瘤抑制因子，也可以作為一種原癌基因在腫瘤的發生、發展過程中發揮重要的作用[4]。小腦變性相關蛋白1反義轉錄物（cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，CDR1as）是一種miRNA的拮抗劑，作為微小 RNA-7（microRNA-7，miRNA-7）海綿影響miRNA-7靶基因的活性[5]。此外，miRNA-671可與CDR1as完全互補并引起其降解[6]。

3 circRNA-miRNA軸在腫瘤中的研究

3.1 circRNA-miRNA軸在神經膠質瘤中的研究

Zheng等[7]研究表明，環狀τ-微管蛋白激酶2（tau tubulin kinase 2，TTBK2）在神經膠質瘤組織和細胞系中的表達上調，而線性TTBK2在神經膠質瘤組織和細胞系中并無差異性表達。環狀TTBK2的高表達可以促進膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制其凋亡。環狀TTBK2可以作為miRNA-217海綿抑制miRNA-217的表達，從而影響下游靶基因肝細胞核因子 1β（hepatocyte nuclear factor 1 beta，HNF1β）的表達以及膠質瘤的生物學行為。

3.2 circRNA-miRNA軸在多形性膠質母細胞瘤中的研究

研究表明，在45例多形性膠質母細胞瘤患者的組織中和5例多形性膠質母細胞瘤患者的細胞系中，miRNA-671-5p呈現過表達，并且影響了多形性膠質母細胞瘤細胞的遷移，在較小程度上影響了膠質母細胞瘤細胞的增殖。此研究利用生物信息學預測確定CDR1as、CDR1、VSNL1為miRNA-671-5p的靶基因，它們在膠質母細胞瘤中的表達均下調，且與miRNA-671-5p有關，故認為miRNA-671-5p/CDR1as/CDR1/VSNL1軸可以影響多形性膠質母細胞瘤細胞的生物學行為[8]。

3.3 circRNA-miRNA軸在肝細胞癌中的研究

在肝細胞癌中，hsa_circ_0005986的表達下調，其可以作為miRNA-129-5p的海綿，使miRNA-129-5p得到釋放，進而使下游靶基因Notch1的表達下調，加速肝癌細胞的增殖，促進肝癌細胞由G0/G1期向S期轉變[9]。Huang等[10]利用circRNA芯片檢測出226個在肝細胞癌組織中差異性表達的circRNA，其中，189個circRNA的表達上調，37個circRNA的表達下調。circRNA-100338是上調的circRNA之一，作為內源性海綿與miRNA-143-3p結合從而影響肝癌細胞的侵襲。該研究認為，circRNA-100338是對肝細胞癌的診斷和治療具有潛在價值的標志物。Xu等[5]研究證實，ciRS-7（CDR1as）在并發微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）的組織中的表達與miRNA-7的表達呈負相關，ciRS-7可以作為肝MVI的生物標志物和MVI治療的靶向標志。circMTO1在肝細胞癌組織中的表達明顯下調，circMTO1作為致癌基因miRNA-9的海綿來影響p21的表達。有研究認為，circ-MTO1是肝細胞癌治療的潛在靶點，肝細胞癌組織中circMTO1表達的下降可以作為預測患者預后的指標[11]。Shang等[12]采用定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）驗證肝細胞癌組織中3個circRNA的表達，結果發現，hsa_circ_0005075的表達差異最明顯，且相對表達量與肝細胞癌的腫瘤大小有關，并構建了以hsa_circ_0005075為中心的circRNA-miRNA相互作用網絡，包括 miRNA-23b-5p、miRNA-93-3p、miRNA-581、miRNA-23a-5p，其關系有待進一步研究證實。研究表明，與正常肝組織相比，CDR1as在肝細胞癌組織中的表達上調，miRNA-7在肝細胞癌組織中的表達下調。此外，敲除CDR1as、過表達miRNA-7可以抑制肝癌細胞的增殖和侵襲。miRNA-7過表達可以抑制其下游靶基因CCNE1和PIK3CD的表達，敲除CDR1as可以抑制miRNA-7的表達，也可以抑制CCNE1和PIK3CD基因的表達[13]。

3.4 circRNA-miRNA軸在骨肉瘤中的研究

有研究表明，circUBAP2在人骨肉瘤組織中的表達有所增加，與骨肉瘤的進展和預后密切相關，表達上調的circUBAP2可以促進骨肉瘤細胞的生長并抑制其凋亡。circUBAP2通過抑制miRNA-143的表達，影響抗凋亡基因B細胞淋巴瘤因子-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達[14]。

3.5 circRNA-miRNA軸在胃癌中的研究

circRNA_100269在胃癌組織中的表達水平降低，雙熒光素酶實驗證實circRNA_100269與miRNA-630靶向結合，且miRNA-630在胃癌組織中呈現高表達，并與circRNA_100269呈負相關，過表達circRNA_100269抑制了miRNA-630的表達，同時抑制了胃癌細胞的增殖[15]。miRNA-7過表達可以抑制胃癌細胞的惡性生物學行為，并且這種抑制作用可以被作為miRNA-7海綿的ciRS-7的過表達所中和，且二者的相互作用進一步影響人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源/磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B（phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten/phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase/protein kinase B，PTEN/PI3K/AKT）通路[16]。

3.6 circRNA-miRNA軸在乳腺癌中的研究

Liang等[17]通過circRNA芯片篩選出乳腺癌組織中差異表達的circRNA，發現circ-ACBC10在乳腺癌組織中的表達上調，沉默circ-ACBC10可以抑制乳腺癌細胞的增殖并促進其凋亡。通過生物信息學預測與熒光素酶報告基因實驗證實，circ-ACBC10與miRNA-1271靶向結合，并且circ-ACBC10作為miRNA-1271海綿影響乳腺癌細胞的生物學行為。

3.7 circRNA-miRNA軸在肺癌中的研究

有研究證實，cir-ITCH作為miRNA-7與miRNA-214的海綿通過增強其親本基因ITCH的表達抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而抑制肺癌的進展[18]。Tian等[19]在前期研究中證實，肉桂醛（cinnamaldehyde，CA）可以誘導3種非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）細胞發生凋亡，然后通過芯片及熒光定量PCR發現hsa_circ_0043256的表達在CA處理的NSCLC細胞中上調，其可以抑制NSCLC細胞的增殖并誘導其凋亡。通過生物信息學預測并應用熒光素酶實驗驗證，hsa_circ_0043256作為miRNA-1252海綿，可調節親本基因ITCH的表達并影響Wnt/β-catenin信號通路。hsa_circ_0043256/miRNA-1252/ITCH軸介導的新機制為肺癌的治療提供了新的方向。

3.8 circRNA-miRNA軸在食管鱗狀細胞癌中的研究

Li等[20]利用PCR實驗分析了來自中國東部和南部共684例食管鱗癌患者的食管鱗狀細胞癌組織與相應癌旁組織中cir-ITCH的表達水平，發現與癌旁組織相比，cir-ITCH在食管鱗狀細胞癌組織中的表達水平較低。cir-ITCH發揮海綿作用與miRNA-7、miRNA-17、miRNA-214 結合，使 ITCH的表達上調，使磷酸化Dvl2發生泛素化并降解，進而阻斷Wnt/β-catenin信號通路。

3.9 circRNA-miRNA軸在結直腸癌中的研究

在結直腸癌中，circ-001569與miRNA-145的表達呈負相關，miRNA-145與E2F5的表達呈負相關，BAG4與FMNL2的表達呈負相關，通過circ-001569-miRNA-145-E2F5/BAG4/FMNL2 軸影響腫瘤細胞的增殖和侵襲[21]。Zhang等[22]采用定量PCR檢測has_circ_0020397和miRNA-138在結直腸癌細胞中的表達情況，發現has_circ_0020397的表達上調，miRNA-138的表達下調，兩者的表達呈負相關。在證實二者存在差異性表達且表達具有相關性后，應用雙熒光素酶報告基因實驗驗證了二者的靶向結合與結合位點。has_circ_0020397可以增強結直腸癌細胞的活力，促進結直腸癌細胞的侵襲，并抑制其凋亡，而miRNA-138具有相反的作用。

3.10 circRNA-miRNA軸在膀胱癌中的研究

Huang等[23]利用芯片檢測4例膀胱癌患者癌組織及癌旁組織中lncRNA、circRNA和信使RNA（messenger RNA，mRNA）的表達圖譜，檢測出數千個顯著改變的lncRNA和mRNA以及數百個circRNA。5個lncRNA和4個mRNA通過實時熒光定量PCR在30例患者的癌組織與癌旁組織中得到證實，circRNA-MYLK作為miRNA-29a-3p海綿使靶基因DNMT3B、VEGFA和ITGB1的表達上調。Zhong等[24]通過circRNA芯片篩選出在膀胱癌組織中差異表達的circRNA，并采用定量PCR驗證，利用生物信息學方法預測可能與之結合的miRNA，隨后證實circTCF25的過表達可以下調miRNA-103a-3p和miRNA-107的表達，上調CDK6的表達，促進膀胱癌細胞在體內和體外的增殖、轉移，因此，circTCF25可能成為膀胱癌新的標志物。

3.11 circRNA-miRNA軸在基底細胞癌中的研究

Sand等[25]在基底細胞癌中發現了71個差異表達的circRNA，且circRNA與miRNA有結合位點，提示circRNA-miRNA軸在基底細胞癌中也發揮作用。

3.12 circRNA-miRNA軸在婦科腫瘤中的研究

CDR1as與環形的睪丸特異性RNA分子SRY是兩個經典的circRNA，它們含有miRNA-7和miRNA-138結合元件，且miRNA-7和miRNA-138在卵巢癌和宮頸癌中發揮抑制作用[26-27]。

3.13 其他

Zheng等[28]通過測序篩選出在6種正常組織（腦、結腸、心臟、肝、肺和胃）和7種腫瘤（膀胱尿路上皮細胞癌、乳腺癌、結直腸癌、肝細胞癌、胃癌、腎細胞癌和前列腺癌）組織中存在差異性表達的circRNA——circHIPK3。進而通過熒光素酶實驗得出circHIPK3直接結合miRNA-124并抑制miRNA-124的活性的結論。

4 小結與展望

如今，惡性腫瘤的發病率呈逐年上升趨勢，因此，尋找到早期診斷腫瘤的標志物以及有效的治療靶點顯得尤為重要。circRNA早在20世紀就已經被發現，但是都認為它是一種拼接錯誤，并未引起重視，近幾年來，證實其廣泛存在于生物體內，使人們對真核生物轉錄組的認識更加深刻。circRNA在生物體內的作用越來越受到人們的重視，尤其在腫瘤方面，circRNA成為繼miRNA、lncRNA后新的研究熱點。但是，這個領域依然存在很多問題，例如逆轉錄過程中的模板轉換和滾環擴增、缺乏命名circRNA的統一標準等。同時可以看出，除了對CDR1as-miRNA-7和cir-ITCH-miRNA7/214這兩種circRNA-miRNA軸的研究較多外，對其他circRNA-miRNA軸的研究均相對較少[29-30]。從疾病方面可以看到，circRNA-miRNA軸在肝細胞癌中的研究較多，在其他惡性腫瘤中的研究較少，在婦科腫瘤中更是少有研究。同時，對circRNA-miRNA軸的形成機制、功能及其在腫瘤中作用的研究還不夠深入。研究者應該借鑒miRNA與lncRNA的研究思路，建立全面的、不斷更新的circRNA數據庫并形成circRNA-miRNA-mRNA網絡，將幾種ncRNA的研究聯系在一起。更多的circRNA需要被發現，而它的保守性、穩定性及組織特異性的特點使它有望成為新的腫瘤標志物和腫瘤治療的新靶點，為臨床的診斷和治療提供新的視角和新的方向，也為明確circRNA-miRNA軸在多種腫瘤發生、發展中的作用、機制以及為開發新的抗腫瘤藥物提供了新的思路。