循環(huán)腫瘤細(xì)胞在小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展△

王瑩，張同梅，李寶蘭#

1首都醫(yī)科大學(xué)石景山教學(xué)醫(yī)院北京市石景山醫(yī)院腫瘤科，北京 100043

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京市胸科醫(yī)院，北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所綜合科，北京 101149

肺癌是世界范圍內(nèi)腫瘤患者死亡的首要原因，其中小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）占全部肺癌患者的13%～15%[1]。目前針對SCLC的治療仍以放化療為主，雖然SCLC對化療藥物高度敏感，但大部分患者1年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移病灶多為遠(yuǎn)處臟器[2]，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的根源[3]。SCLC的生物學(xué)特性與非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）完全不同，在疾病早期外周血中已經(jīng)存在CTC，且SCLC患者CTC的數(shù)量明顯高于NSCLC患者，CTC與預(yù)后及療效相關(guān)[4-5]。由于CTC表型、表達(dá)譜與原發(fā)腫瘤具有同源性，且獲取標(biāo)本方便，可重復(fù)性強(qiáng)，因此，實時檢測CTC，對SCLC的早期診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測、療效評估、制定個體化治療方案及判斷預(yù)后均有重要的臨床意義。

1 CTC的檢測方法

在外周血中CTC數(shù)量稀少，如何對其進(jìn)行精準(zhǔn)檢測一直是學(xué)術(shù)界研究的難點及熱點，理想的CTC分離檢測方法應(yīng)兼顧靈敏度、特異度，并對細(xì)胞純度、細(xì)胞活力及檢測效率有較高的要求。CTC的獲取通常由富集和檢測兩個部分組成，現(xiàn)有的富集方法主要針對腫瘤細(xì)胞的生物、物理學(xué)特性進(jìn)行，包括依賴腫瘤細(xì)胞大小的過濾法和依賴腫瘤標(biāo)志物的富集法，后者又分為陰性富集法和陽性富集法。陰性富集即差相富集，通過標(biāo)記去除非CTC達(dá)到間接分離的目的；陽性富集即抗體捕獲，指利用腫瘤標(biāo)志物直接獲取CTC。后續(xù)的鑒定包括細(xì)胞和核酸水平的檢測。目前，主流檢測技術(shù)包括細(xì)胞水平的CellSearch、CTC芯片、插入人端粒酶啟動子和綠色熒光蛋白基因的單純皰疹病毒法（oHSV1-hTERT-GFP）、流式細(xì)胞檢測技術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）和膜濾過分離腫瘤細(xì)胞技術(shù)（isolation by size of epithelial tumor cell，ISET）等；核酸水平的檢測方法主要有實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）和差相富集-免疫熒光原位雜交技術(shù)（substrction enrichment and immunostaining fluorescence in situ hybridization，SE-iFISH）。以下簡要概述當(dāng)前具有代表性的3種檢測方法。

1.1 CellSearch系統(tǒng)

CellSearch系統(tǒng)是唯一經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的CTC檢測平臺，可通過正向選擇分離血液中表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）的細(xì)胞，然后通過免疫熒光染色界定EpCAM陽性、CK陽性、DAPI陽性、CD45陰性的細(xì)胞為CTC。CellSearch系統(tǒng)自動化程度高且可重復(fù)性強(qiáng)，但該系統(tǒng)會遺漏缺失上皮細(xì)胞表面特征的腫瘤細(xì)胞，如經(jīng)過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelialmesenchymal transition，EMT）后的CTC，且與免疫磁珠及抗體結(jié)合后的CTC無法進(jìn)行后續(xù)研究[6]。

1.2 qRT-PCR法

qRT-PCR法主要是通過檢測外周血中腫瘤標(biāo)志物mRNA來預(yù)估腫瘤細(xì)胞的存在。目前中國應(yīng)用比較廣泛的如靶向葉酸受體、EpCAM等不同標(biāo)志物陽性的PCR檢測CTC技術(shù)，qRT-PCR靈敏度高，可在106～107個外周血細(xì)胞中檢測出單個腫瘤細(xì)胞，但因不同類型腫瘤的CTC之間存在腫瘤標(biāo)志物表達(dá)量的差異，檢測出的標(biāo)志物含量并不能真實反映CTC數(shù)量，亦無法進(jìn)行后續(xù)進(jìn)一步研究[7]。

1.3 SE-iFISH技術(shù)

SE-iFISH結(jié)合了差相富集和免疫熒光原位分子探針技術(shù)，可對富集的CTC進(jìn)行原位染色體異倍體檢測，另外能結(jié)合不同的腫瘤標(biāo)志物包括上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及干細(xì)胞進(jìn)行檢測。既避免了因EMT等原因?qū)е碌哪[瘤標(biāo)志物低表達(dá)甚至不表達(dá)進(jìn)而造成假陰性結(jié)果，還能鏡下觀察染色體異倍體的CTC和循環(huán)腫瘤微栓（circulating tumor microemboli，CTM）。其優(yōu)勢在于可根據(jù)CTC腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)及染色體倍體的差異將具有不同臨床意義的CTC進(jìn)行亞類分型并進(jìn)行后續(xù)研究[8]。該技術(shù)人工操作流程復(fù)雜，檢測費用昂貴，可能會限制其臨床應(yīng)用，還需更多的后續(xù)研究以簡化流程，降低檢測成本。

2 CTC在SCLC中的臨床應(yīng)用

2.1 CTC與SCLC篩查及早期診斷

SCLC早期診斷是延長患者生存期的關(guān)鍵因素。早在20世紀(jì)90年代Kurusu等[9]應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)對103例有手術(shù)機(jī)會的早、中期NSCLC患者進(jìn)行術(shù)前CTC檢測，發(fā)現(xiàn)62例陽性，而對照組47例（15例肺間質(zhì)纖維化患者，32例健康人）均為陰性，提示CTC可于肺癌早期出現(xiàn)血源播散。SCLC較NSCLC更易于出現(xiàn)早期血行轉(zhuǎn)移，但理論上CTC是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的必要條件。臨床上可以檢測到實體瘤前，CTC已存在于外周血中，這一結(jié)論已經(jīng)在小鼠惡性黑色素瘤模型上得到論證[10]，因此有效捕獲CTC，可極大提高早期SCLC的診斷率。Ilie等[11]應(yīng)用ISET技術(shù)對245例非腫瘤人群進(jìn)行CTC檢測，其中包括168例慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者，77例健康人（42例吸煙，35例不吸煙）。168例COPD患者中5例CTC檢測陽性，該5例患者在后續(xù)1～4年的隨訪中均發(fā)現(xiàn)肺部結(jié)節(jié)并手術(shù)確診為早期NSCLC，提示CTC檢測可以早于胸部計算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）發(fā)現(xiàn)影像學(xué)不可見的早期腫瘤，其在肺癌早期篩查中有巨大的臨床應(yīng)用前景。隨著中國胸部低劑量螺旋CT在肺癌早期篩查中的日漸普及，如何精準(zhǔn)鑒別體檢發(fā)現(xiàn)的肺部良惡性小結(jié)節(jié)是腫瘤科醫(yī)師日常需要面臨的臨床問題，除需警惕影像學(xué)的高危征象及一系列的隨訪策略外，CTC檢測能否在良惡性肺結(jié)節(jié)早期病變判斷上占有一席之地得到關(guān)注。日本學(xué)者Tanaka等[12]應(yīng)用CellSearch技術(shù)對150例疑為肺癌的患者進(jìn)行CTC檢測，結(jié)果提示125例最終確診為肺癌的患者（腺癌85例，鱗癌22例，SCLC 9例，其他類型肺癌9例）中CTC的陽性率為30.6%，另外25例肺良性疾病患者的CTC陽性率為12.0%，肺癌患者的CTC數(shù)量明顯高于肺部良性疾病患者，但受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析顯示，CTC檢測對鑒別肺部良惡性疾病無臨床意義[12]。而近年來中國Chen等[13]應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對756例受試者（473例NSCLC患者，227例肺部良性疾病患者，56例健康人）進(jìn)行CTC檢測時發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者的CTC水平明顯高于肺部良性疾病患者（P＜0.01）及健康人（P＜0.01）；ROC曲線分析顯示，與血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、細(xì)胞角質(zhì)蛋白19片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）比較，CTC診斷效能更佳，其診斷Ⅰ期NSCLC的靈敏度可達(dá)67.2%，CTC檢測聯(lián)合上述3種腫瘤標(biāo)志物診斷肺癌的靈敏度及特異度分別達(dá)88.78%、87.36%，可有效提高肺部良惡性疾病鑒別診斷的準(zhǔn)確率。因此，CTC聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物檢測可在一定程度上彌補(bǔ)影像學(xué)診斷的不足，且操作簡便，風(fēng)險低。

2.2 CTC與SCLC療效評價

當(dāng)前SCLC患者的療效評價主要通過影像測量腫瘤病灶大小進(jìn)行判斷，然而影像學(xué)檢查時微轉(zhuǎn)移病灶很難被發(fā)現(xiàn)。近年來研究表明，CTC在肺癌療效預(yù)測及評價方面具有一定的臨床價值。Nagrath等[14]應(yīng)用CTC芯片技術(shù)對9例實體瘤（其中2例肺癌）患者進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測CTC時發(fā)現(xiàn)，化療前后CTC的數(shù)量變化與CT檢查結(jié)果具有高度的一致性，相較于影像學(xué)檢查，CTC動態(tài)監(jiān)測能更早地評價藥物療效，輔助臨床醫(yī)師對化療無效的患者更快地做出臨床決策。Wu等[15]通過CellSearch系統(tǒng)對12例化療2個周期的肺癌患者進(jìn)行CTC數(shù)量監(jiān)測時發(fā)現(xiàn)，CTC計數(shù)與影像學(xué)特征的變化趨勢一致，CTC可作為肺癌患者化療效果的有效評價指標(biāo)。有關(guān)CTC在SCLC患者療效評價中的意義仍存在一定的分歧。中國Wang等[16]在應(yīng)用Cell-Search系統(tǒng)對96例SCLC初治患者于一線化療前后進(jìn)行CTC動態(tài)監(jiān)測時發(fā)現(xiàn)，CTC數(shù)量與血清NSE水平相關(guān)，與藥物客觀緩解率（objective response rate，ORR）及疾病控制率（disease control rate，DCR）無關(guān)。而Normanno等[17]通過CellSearch系統(tǒng)對60例廣泛期SCLC患者于化療前及化療1個周期后進(jìn)行CTC數(shù)量監(jiān)測時發(fā)現(xiàn)，54例（90%）SCLC初治患者的基線CTC檢測陽性（CTC數(shù)量為0～24 281），化療1個周期后CTC數(shù)量較基線水平減少＞89%的患者死亡風(fēng)險明顯小于基線水平減少≤89%的患者[風(fēng)險比率（hazard ratio，HR）=0.24；95%CI：0.09～0.61]，該研究認(rèn)為化療 1 個周期后CTC數(shù)量變化是有效的療效預(yù)測指標(biāo)，可對后續(xù)治療起到指導(dǎo)作用。中國Shen等[18]應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對80例SCLC患者葉酸受體陽性CTC進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，結(jié)果顯示67例（83.8%）患者基線CTC陽性（每3 ml外周血CTC≥8.7 FU），化療2個周期后CTC下降數(shù)量與腫瘤部分緩解（partial response，PR）相關(guān)（P=0.0380），但與疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）無關(guān)（P=0.4934）。因此，SCLC治療過程中實時監(jiān)測CTC，有一定的參考價值，但尚缺乏大樣本前瞻性研究的相關(guān)證據(jù)支持。

2.3 CTC與SCLC預(yù)后判斷

CTC數(shù)量與多種實體瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，基于前期多項臨床研究，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)Cell-Search系統(tǒng)應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌的預(yù)后評估以及無進(jìn)展生存時間（progression free-survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）的預(yù)測[19-21]。當(dāng)前臨床醫(yī)師判斷SCLC預(yù)后主要依據(jù)腫瘤分期、腫瘤標(biāo)志物水平及體能狀態(tài)（performance status，PS）評分。CTC檢測可以輔助其他參考指標(biāo)有效判斷肺癌預(yù)后。Aggarwal等[22]開展的一項前瞻性研究應(yīng)用CellSearch系統(tǒng)對50例SCLC初診患者（20例局限期，30例廣泛期）化療前及化療1～4個周期后進(jìn)行連續(xù)CTC檢測，結(jié)果提示局限期SCLC患者的CTC基線水平明顯低于廣泛期SCLC患者（1.5vs71.0，P=0.0004），CTC基線水平＜50的患者PFS及OS明顯高于≥50的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0002、0.0116）[22]。Shi等[23]通過聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）對55例SCLC患者化療前及化療1個周期、3個周期后外周血細(xì)胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）mRNA進(jìn)行檢測，結(jié)果提示化療前CTC檢測陽性而化療1、3個周期后轉(zhuǎn)為陰性的患者的PFS、OS明顯長于CTC檢測連續(xù)陽性的患者（P=0.008、0.010），動態(tài)監(jiān)測CK19陽性的CTC可有效判斷SCLC患者預(yù)后。Hou等[24]應(yīng)用CellSearch系統(tǒng)對50例SCLC患者外周血標(biāo)本進(jìn)行CTC檢測，結(jié)果提示43例（86%）患者CTC陽性，CTC的中位數(shù)明顯高于其他實體瘤，提示SCLC患者中Ep-CAM陽性的CTC數(shù)量豐富，進(jìn)一步分析提示CTC數(shù)量＞300的患者OS明顯低于CTC數(shù)量＜2的患者（P＜0.01）。上述各項研究納入的病例數(shù)較少，CTC檢測方法及臨界值也不相同。Zhang等[25]對7項研究共計440例SCLC患者的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了薈萃分析，結(jié)果提示基線CTC數(shù)量與患者OS（HR=1.9，95%CI：1.19～3.04；Z=2.67，P＜0.01）及 PFS（HR=2.6，95%CI：1.9～3.54；Z=6.04，P＜0.01）均有關(guān)。與上述結(jié)論不同，Hiltermann等[4]對59例SCLC患者的CTC進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示CTC基線數(shù)量與化療療效無關(guān)，化療1個周期后CTC數(shù)量≥2是僅次于腫瘤分期的最佳預(yù)后評估指標(biāo)（HR=3.1，95%CI：1.4～6.6；P＜0.01）。腫瘤組織分子標(biāo)志物和CTC計數(shù)相結(jié)合可提供更多的臨床信息，外周血中發(fā)生EMT和具有干細(xì)胞特性的CTC更容易發(fā)生免疫逃逸，成為腫瘤日后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源[26]。Hamilton和Rath[27]報道復(fù)發(fā)SCLC細(xì)胞株CTC中可見EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)，可能與腫瘤的侵襲性及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移特性相關(guān)。Chang等[28]報道SCLC患者上皮細(xì)胞標(biāo)志物EpCAM的高表達(dá)提示預(yù)后較好。另有研究指出c-met過表達(dá)SCLC患者臨床預(yù)后差[29]。然而，Pore等[30]利用免疫組化技術(shù)對38例SCLC原發(fā)腫瘤組織進(jìn)行了干細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCLC腫瘤組織間質(zhì)細(xì)胞表型（c-metHE-cadL），提示外周血CTC計數(shù)少，CTC≥2是優(yōu)于疾病分期及CTC標(biāo)志物的最佳生存預(yù)后評估指標(biāo)（HR=3.43，95%CI：1.46～8.03；P=0.005），而腫瘤組織中干細(xì)胞標(biāo)志物SOX2和CD44的表達(dá)與患者OS無關(guān)。因此，CTC在判斷SCLC患者預(yù)后方面有重要的臨床意義且研究結(jié)論較為一致，不同亞型CTC與預(yù)后的關(guān)系值得進(jìn)一步探索。

2.4 CTC與SCLC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移

SCLC患者對放化療高度敏感，但后續(xù)的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是患者主要死亡原因，也是臨床治療難題，外周血中存活的CTC、CTM被認(rèn)為是造成SCLC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committeeon Cancer，AJCC）2010年《腫瘤分期指南》將CTC作為一個新的M分期標(biāo)準(zhǔn)，作為 cM（i+）出現(xiàn)在 M0和M1之間[31]。文獻(xiàn)報道，肺癌患者術(shù)后外周血中CTC的存在可有效提示腫瘤復(fù)發(fā)，CTC數(shù)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)是肺癌根治術(shù)后患者無疾病生存期（disease-free survival，DFS）的獨立影響因素[32]。另有研究發(fā)現(xiàn)，CTC數(shù)量與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶數(shù)目有明確的相關(guān)性，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌患者外周血CTC數(shù)量明顯升高，CTC可作為監(jiān)測肺癌轉(zhuǎn)移的有效標(biāo)志物[12]。目前針對CTC與SCLC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移關(guān)系的文獻(xiàn)報道仍然較少，期待能有更多、更客觀的臨床研究開展。

3 前景與展望

近年來，隨著CTC富集與檢測技術(shù)的不斷革新，人們對CTC的臨床應(yīng)用有了更加深入的認(rèn)識，有關(guān)CTC在SCLC領(lǐng)域中的研究也陸續(xù)更新。在當(dāng)前精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的背景下，免疫檢查點抑制劑及靶向治療藥物Rova-T的出現(xiàn)給SCLC的治療困局帶來新的希望，尋求可反復(fù)取樣、動態(tài)監(jiān)測的手段是對SCLC患者實施個體化治療的前提。盡管CTC在SCLC的早期診斷、療效評價、預(yù)后評估及復(fù)發(fā)檢測方面的作用已被大量研究證實，但將CTC檢測應(yīng)用于SCLC臨床實踐中仍任重道遠(yuǎn)。首先，CTC檢測技術(shù)的原理和方法不同導(dǎo)致檢測結(jié)果及判讀標(biāo)準(zhǔn)存在較大差異，CTC分離與鑒定技術(shù)亟待規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化；其次，CTC與SCLC療效監(jiān)測及預(yù)后關(guān)系缺乏多中心大樣本研究結(jié)果確認(rèn)；最后，CTC亞群CSC、EMT及CTM在SCLC患者中有不同的臨床意義，探討不同個體CTC分子表型差異及同一個體CTC的異質(zhì)性，也將是未來的研究重點。