肺癌早期篩查方法的研究進展

王水蓮，楊芳

吉林大學第一醫院腫瘤中心，長春 130021

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，由于其發病隱匿，早期臨床癥狀不典型，診斷率較低，具有高發病率與高病死率的特點，嚴重危害人類健康與生命安全。文獻報道，2015年中國肺癌新發病例約73萬，死亡病例約61萬[1]。另有文獻報道，僅16%的肺癌患者在早期被診斷，大多數患者就診時疾病已進展至晚期，錯過了最佳治療時機[2]。肺癌患者的預后與臨床分期密切相關，Ⅳ期肺癌患者的5年生存率僅為4%[2]，而ⅠA期肺癌患者接受合理治療后，10年生存率可高達92%[3]。因此，早篩查、早診斷、及時進行臨床干預是改善肺癌預后的關鍵。

作為肺癌早期的常規篩查手段，應在兼具無創、不良反應小、操作簡便、費用合理等要求的同時，盡可能提高檢出率。目前針對肺癌早期篩查的方法主要包括影像學和生物學方法，即胸部X線檢查、胸部CT、血清生物學標志物等診斷技術。此外，痰脫落細胞學檢查因取材方便、可反復取材、操作簡單易行、患者痛苦小等特點，也是肺癌早期篩查的方法之一。本文主要對目前的肺癌早期篩查方法進行歸納總結。

1 痰脫落細胞學檢查

采用痰脫落細胞學檢查對肺癌進行早期篩查，是建立在對肺癌細胞形態學識別的基礎上發現早期肺癌的一種重要手段。研究表明，痰脫落細胞學檢查診斷肺癌的靈敏度為16%，特異度為99%，此項檢查技術對中心型鱗狀細胞癌最敏感，對腺癌則敏感性較差[4-5]。應用傳統的痰細胞涂片技術，惡性腫瘤細胞在污穢的背景中呈散雜或成群排列，細胞缺乏完整性，細胞核結構不清，且多混雜于黏液中，給讀片帶來難度，加之痰標本中腫瘤細胞過少、細胞易變形、組織變異和形態上的不典型增生等多方面影響，其陽性檢出率偏低，漏診率較高。隨后采用薄層液基細胞學技術用于痰脫落細胞學檢查，由于薄層細胞涂片去除了黏液、紅細胞等雜質成分，保證了細胞的完整無損，提高了腫瘤細胞的陽性檢出率。薄層液基細胞學技術檢測肺癌的靈敏度為87.5%，與傳統的涂片法相比，靈敏度提高了24.5%[6]。但是，薄層液基細胞學涂片由于在標本處理時破壞了腫瘤細胞的排列方式和涂片背景，不利于病理分類。因此，臨床上往往把痰脫落細胞學檢查與其他檢測技術聯合應用。

2 影像學檢查

2.1 胸部X線檢查

胸部X線檢查是傳統的影像學檢查手段，能夠觀察胸部結構的整體，具有經濟方便、放射劑量小等特點，主要用于初步檢查，便于發現一些較明顯的病變。但是該檢查是一種重疊成像，整體分辨率較低，對于密度低的小病灶及隱蔽性好的病灶易漏診，對無癥狀小結節的Ⅰ期肺癌患者常效果欠佳。因此，僅依靠X線檢查難以確保診斷的全面性和準確性。

肺癌篩查的大樣本研究結果顯示，胸部X線檢查單獨應用或與痰脫落細胞學檢查聯合應用時，不能降低肺癌患者的病死率[7-8]。

2.2 胸部CT

胸部CT橫斷面成像技術去除了組織重疊成像的干擾，且分辨率高，能夠有效提高對肺內孤立結節、隱蔽部位微小病灶定位診斷的準確性及可靠性。國際肺癌篩查組織對31 567例無癥狀的肺癌高危人群進行CT篩查，肺癌檢出率為1.5%（484/31 567），其中85%屬于Ⅰ期肺癌[3]，CT對早期肺癌的檢出率是胸部X線檢查的6倍[9]。但常規CT的放射劑量大，掃描時間長，不適用于肺癌篩查。低劑量CT（low-dose computed tomography，LDCT）僅需患者屏息數秒即可完成胸部掃描，其放射劑量僅為3.3 mV，相當于一個人全年自然環境的放射總量。與常規CT相比，LDCT對肺內小結節有著相同的檢出能力[10]。美國國家肺癌篩查試驗（National Lung Screening Trial，NLST）研究結果顯示，與胸部X線檢查相比，LDCT可將肺癌的病死率降低20%～30%。隨后美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）更新了肺癌篩查指南，以Ⅰ類證據級別推薦在高危人群中采用LDCT作為肺癌早期篩查手段[11]。

然而，LDCT篩查也存在很多問題，包括假陽性率高以及假陽性結果引起的心理焦慮、過度診斷、輻射風險、對結節的鑒別能力較差、醫療費用較高等問題[12]。其中，假陽性率過高是LDCT篩查最突出的問題。在NLST中，3輪篩查的陽性率分別為27.3%、27.9%和16.8%，總陽性篩查率為24.2%（X線組為6.95%），但陽性結果中有96.4%為假陽性[13]。Croswell等[14]對LDCT篩查和胸部X線檢查的假陽性率進行比較分析，結果顯示，1次LDCT篩查的假陽性率為21%，X線組為9%；2次LDCT篩查的累積假陽性率為33%，X線組為15%；在LDCT組中，7%的假陽性患者接受了侵入性檢查，而X線組為4%。

因此，單純依靠LDCT進行肺癌早期篩查并不能對疾病做出準確判斷。針對高危人群進行肺癌早期篩查，篩查方法應具有無創、價格合理、可普及等特點，隨著分子生物學技術的發展，一些新型的靈敏度和特異度較高的肺癌血清學生物標志物與LDCT聯合應用，有望進一步提高早期肺癌的檢出率與診斷準確度。

3 血清學生物標志物

目前，病理組織活檢依然是肺癌診斷的金標準，隨著免疫組織化學技術的發展，采用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）或新一代的基因測序技術對驅動基因進行測序已經成為標準診療程序。然而組織活檢是侵入性檢查，理想的檢查方法在涵蓋腫瘤生物學特征和異質性的同時，還應具有可重復性并易于操作。腫瘤血清學生物標志物是由腫瘤細胞或腫瘤微環境分泌而正常組織不能分泌或生成的物質，在人體的體液（血液、尿液、痰液等）中可以被檢測到。目前應用于肺癌早期篩查的生物學標志物主要有腫瘤標志物、肺癌自身抗體、循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）、血清微小 RNA（microRNA，miRNA）等。血清學生物標志物檢測方法具有取材方便的優勢，可以實時監測腫瘤的動態變化，隨著分子生物學技術的不斷成熟，其診斷價值受到了廣泛關注。

3.1 腫瘤標志物

腫瘤標志物是腫瘤發生發展過程中，由腫瘤細胞本身產生或是機體對腫瘤細胞反應而產生的物質，在腫瘤組織中的含量明顯升高[15]。目前已經發現多種腫瘤標志物與腫瘤的診斷、分期、治療及預后有關。臨床上廣泛應用的肺癌腫瘤標志物主要有癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細胞角質蛋白19片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）、胃泌素釋放肽前體（precursor of gastrin-releasing peptide，proGRP）和鱗狀上皮細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCCA）。研究表明，proGRP在小細胞肺癌患者血清中的含量明顯升高，其診斷小細胞肺癌的靈敏度為75%，特異度為100%；CEA在肺腺癌患者血清中的含量較高；CYFRA21-1和SCCA在鱗狀細胞癌患者血清中的含量較高。單一腫瘤標志物檢測的靈敏度和特異度均不高，若4種標志物（CEA+CYFRA21-1+proGRP+SCCA）聯合檢測，靈敏度可達76.6%，特異度可達94.4%[16]。雖然這些標志物在肺癌患者血清中的含量較高，但在一些肺部良性病變和其他腫瘤中，也可呈現陽性結果。鑒于肺癌組織病理的多樣性、肺癌的異質性以及生物學行為的復雜性，目前尚未發現某種靈敏度和特異度均較高的腫瘤標志物，哪些標志物聯合檢測的特異度和靈敏度最高仍是該領域的研究熱點。

3.2 CTC

CTC是在某些情況下從原發腫瘤或轉移瘤中脫落，進入血液循環的腫瘤細胞。Tanaka等[17]研究發現，肺癌患者血清中CTC的數量明顯多于非惡性疾病患者，30.6%的早期肺癌患者可檢測到CTC，并且隨著肺癌的進展，CTC計數顯著增加。該研究結果提示，對疑似肺癌患者進行CTC檢測，并在分子水平上監測病情變化，有助于發現早期肺癌。CellSearch系統是美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準用于CTC富集的系統，其工作原理是上皮來源的腫瘤細胞表面可表達上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和細胞角蛋白（CK8、CK18、CK19），包被在磁珠上的EpCAM抗體能夠與腫瘤細胞表面的相關抗原特異性結合，然后對富集的樣本進行免疫熒光標記（CK-PE和CD45），最后篩選出EpCAM（+）CK-PE（+）CD45（-）的腫瘤細胞[18]。盡管CellSearch系統被廣泛應用，但其對早期肺癌診斷的靈敏度和特異度均不高，例如在糖尿病、甲狀腺疾病、高膽固醇血癥和良性乳腺病變中均可檢測到CTC[19]。此外，腫瘤細胞在侵襲轉移的過程中可能發生上皮-間充質轉化，而丟失了細胞表面的EpCAM，導致出現漏檢[20]。另一項CTC檢測技術是由中國國家食品藥品監督管理總局（China Food and Drug Administration，CFDA）批準的葉酸受體（folate receptor，FR）靶向聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術。在一些腫瘤組織（如卵巢癌和肺癌組織）中，FR的表達量明顯升高，而在正常組織中，其表達量很低[21]。采用免疫磁珠可以負向富集FR陽性的CTC，然后通過配體靶向PCR定量檢測CTC。有研究表明，FR靶向PCR診斷肺癌的靈敏度為79.6%，特異度為88.2%[22]，對Ⅰ期非小細胞肺癌診斷的靈敏度達67.2%[23]。雖然近幾年各種檢測技術不斷成熟，但CTC檢測仍然存在著挑戰，外周血中CTC的含量極低，在10億個血細胞中僅有幾個CTC，這也是限制CTC在臨床上廣泛應用的主要原因。改進檢測方法、開發新型檢測工具、提高CTC檢測的靈敏度，有助于將CTC早日應用于臨床檢測。

3.3 循環腫瘤DNA

循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是腫瘤細胞釋放到血液中的單鏈或雙鏈DNA分子，它來源于腫瘤細胞，因此攜帶原始腫瘤細胞的基因信息。近年來，隨著腫瘤基因組計劃的完善和下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術的發展，基于ctDNA分析的液體活檢技術可以通過檢測突變狀態反映腫瘤的基因組信息，為腫瘤的診斷和療效評估提供新線索[24]。Newman等[25]采用腫瘤個性化深度測序分析方法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）對Ⅱ～Ⅳ期非小細胞肺癌患者進行ctDNA檢測，靈敏度達到100%；對Ⅰ期非小細胞肺癌患者進行ctDNA檢測，靈敏度為50%，特異度為96%。ctDNA在血液中的濃度很低，且以碎片化形式存在，這是ctDNA檢測的主要難題。目前ctDNA的檢測方法主要有數字PCR（digital PCR，dPCR）、基于流式技術的磁珠乳液擴增方法（bead,emulsion,amplification and magnetic，BEAMing）、標記擴序（tagged-amplicon deep sequencing，TAm-Seq）技術、實時熒光定量PCR、NGS和CAPP-Seq等，這些檢測技術的發展和應用，使ctDNA的檢出率有所增加[26]。但是，目前對ctDNA的研究仍處于前期階段，ctDNA的大小、釋放機制等問題尚未明確；現有檢測技術對ctDNA檢測的靈敏度和特異度均不理想。此外，肺癌的異質性大、突變譜廣，尚未發現診斷早期肺癌的標準ctDNA種類或組合。因此，ctDNA作為肺癌早期篩查方法在人群中的普及仍需進一步的研究。

3.4 血清miRNA

miRNA是一類由20～25個核苷酸組成的內源性非編碼RNA，它們幾乎參與所有細胞生物學行為的調控，并在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。Chen等[27]研究表明，血液miRNA耐酸、耐堿、耐高溫，并能抵抗內源性或外源性RNA酶的降解，在血清中穩定存在。Halvorsen等[28]研究表明，肺癌患者與慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者和健康者的血清miRNA含量不同，并驗證了6種miRNA（miRNA-429、miRNA-205、miRNA-200b、miRNA-203、miRNA-125b和miRNA-34b）在非小細胞肺癌患者中的含量顯著升高，聯合檢測診斷Ⅰ～Ⅱ期肺癌的靈敏度為85%，特異度為74%，曲線下面積為0.88。該研究表明，miRNA具有檢測早期肺癌的能力。Bianchi等[29]通過大型試驗開發了34種miRNA組合，該組合在無癥狀的高危人群中識別非小細胞肺癌的準確率為80%。肺癌患者體內存在大量差異表達的miRNA，大部分miRNA并非由腫瘤細胞釋放，哪些miRNA分子在肺癌的早期診斷中具有重要價值目前尚未明確。因此，篩選肺癌特異性miRNA分子、簡化miRNA分子組合、優化檢測技術，是血清miRNA應用于肺癌早期診斷的關鍵。

3.5 肺癌自身抗體

在腫瘤發病早期，機體的免疫系統即可識別腫瘤細胞內異常表達的蛋白，即腫瘤相關抗原，并分泌針對這些抗原的自身抗體。多項研究顯示，在乳腺癌、食管癌、肝癌、卵巢癌患者的血清中均可檢測到相應的抗體[30-33]。因此，自身抗體是診斷早期惡性腫瘤的潛在生物學標志物。與痰脫落細胞學檢查和CT檢查相比，自身抗體檢測具有以下優勢：①早期診斷的靈敏度高，在腫瘤患者出現臨床癥狀前就能夠檢測到自身抗體的存在；②自身抗體在健康人的血清中沒有或含量很低，在腫瘤患者中的含量較高；③與抗原相比，自身抗體的血清半衰期較長，穩定性較好；④血清樣本易獲得，檢測無創傷，操作簡單，反應靈敏，可對不同階段的腫瘤進行檢測。

Chapman等[34]對肺癌患者和健康人血清中的7種抗體（p53、c-MYC、HER2、NY-ESO-1、CAGE、MUC1、GBU4-5）的表達水平進行了檢測，發現肺癌患者血清中的抗體水平高于健康人；單一抗體的陽性率為5%～36%，聯合檢測的靈敏度為76%，特異度為92%。這一結果提示，單一抗體檢測的靈敏度較低，診斷效能不佳，而多種抗體聯合檢測則能夠彌補單一抗體陽性率較低的不足，進而有效提高肺癌的檢出率。Boyle等[35]研究發現，6種抗體（p53、NY-ESO-1、CAGE、GBU4-5、Annexin1、SOX2）聯合檢測對不同分型、分期肺癌的靈敏度及特異度無明顯差異，提示該抗體組合在不同分型、分期的肺癌組織中表達穩定，對各個分期的肺癌均有診斷意義。Chapman等[36]對小細胞肺癌患者進行檢測，在原有6種抗體組合的基礎上加入HuD抗體，結果顯示，該抗體組合對小細胞肺癌的診斷具有良好的靈敏度和特異度，但Annexin1抗體的靈敏度僅為2%。Chapman等[37]進一步優化抗體組合，對235例肺癌患者進行新的7種抗體組合（p53、NY-ESO-1、CAGE、GBU4-5、SOX2、HuD、MAGEA4）的檢測，此次優化移除了原來靈敏度較低的Annexin1抗體，新加入了MAGEA4抗體。研究結果顯示，新的7種抗體組合的靈敏度為41%，特異度為93%，這7種抗體組合被稱為EarlyCDTLung。Jett等[38]對1613例肺癌高危人群進行EarlyCDT-Lung檢測，靈敏度為41%，其中Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者占57%。以上結果提示，自身抗體聯合檢測有助于發現早期肺癌。2012年英國國家醫療服務體系在蘇格蘭地區進行一項大型前瞻性研究，納入12 000例高風險吸煙人群并進行EarlyCDT-Lung檢測，主要目的是評估EarlyCDT-Lung診斷肺癌的能力，并進一步探究早期檢測是否能使患者長期獲益[39]。該研究的最終結果預計在2019年公布，其結論將明確EarlyCDT-Lung是否可以作為肺癌早期檢測指標在英國開展以及在全世界范圍內廣泛應用。

中國也有多個課題組進行了相關研究，Ren等[40]評估了7種肺癌抗體篩查肺癌的臨床價值，考慮人種、遺傳差異與肺癌的異質性，與國外研究的抗體相比，中國選擇的7種肺癌抗體（p53、GAGE7、PGP9.5、CAGE、MAGEA1、SOX2、GBU4-5）中，4種與國外相同，3種不同。研究納入818例肺癌患者和1176例肺部良性疾病患者，肺癌抗體診斷的靈敏度為61%，特異度為90%；對Ⅰ期和Ⅱ期非小細胞肺癌的靈敏度分別為62%和59%，對局限期小細胞肺癌的靈敏度為59%，對肺部良性疾病患者的特異度高達94%。在此項試驗的540例肺部結節患者中，高分辨率CT（high resolution computed tomography，HRCT）與肺癌抗體聯合診斷的陽性預測值（90.4%）遠遠高于單獨HRCT診斷的陽性預測值（57.6%）。2015年CFDA批準了肺癌抗體檢測試劑盒上市，但目前尚未在臨床廣泛應用。以上研究結果均表明，自身抗體聯合檢測有助于肺癌的早期診斷，但其靈敏度不足，單獨應用不能滿足肺癌早期篩查的需求。因此，進一步提高抗體組合的穩定性和特異性，尋找最佳的早期肺癌抗體組合，并將其與LDCT聯合，或許是肺癌早期篩查的理想模式。

4 小結與展望

建立肺癌早期篩查臨床路徑是提高肺癌早期診斷率，改善患者預后的關鍵。目前尚沒有理想的肺癌篩查模式，血清學生物標志物檢測與LDCT在肺癌早期診斷中均顯示了良好的診斷效能，二者聯合有望成為肺癌早期篩查的理想模式。然而目前對于LDCT篩查肺癌的人群選擇、診斷以及隨訪原則尚未統一，血清學生物標志物的靈敏度不足，檢測組合種類繁多，檢測技術不完善，尋找靈敏度和特異度高的檢測組合，仍需進行大量的臨床研究。