納米顆粒誘導肝臟毒性的研究進展

王 晗倪 娟 周 滔 楊國防 汪 旭*

( 1．云南師范大學生命科學學院，云南 昆 明 650500；2．云南師范大學生物能源持續開發與利用教育部工程研究中心，云南 昆 明 650500；3．上海三譽華夏基因科技有限公司，上海 201100 )

納米顆粒(nanoparticles，NPs)，是指直徑小于100 nm的微粒。納米級的顆粒較正常顆粒(fine particle)而言，具有不同的理化特征，如表面積與體積比增大，活性位點、電荷和形狀改變，表面衍生性增加，光催化活性增強，熱性能更為優越等。目前，NPs已廣泛運用到電子工業、食品產業、建筑材料、紡織品、醫療器械和藥物、個人護理用品如防曬霜等領域[1]。隨著人類越來越多的暴露在含NPs的用品中，NPs對人的健康風險評估已成為研究熱點[2]。研究已證實，NPs對人類健康存在威脅，納米氧化鋅、二氧化鈦、氧化銅、碳納米管、碳富勒烯等進入機體后，可引起重要器官病理性損傷幾率增加，甚至誘發癌癥[3-4]。物理化學特性如顆粒晶體結構、尺寸、化學組成等都可影響NPs毒性，其中，顆粒尺寸是NPs較正常顆粒毒性更大的主要因素，較小的尺寸更易進入并累積到機體深層，影響器官及細胞正常活動，顆粒尺寸減小將引起顆粒表面積增大，同時也增加了活細胞中的化學反應性和顆粒的可穿透性[5-6]。

NPs以吸入(inhalation)、皮膚滲透(dermal penetration)和口服攝入(ingestion)三種最為常見的途徑進入人體，隨食物或空氣吞入的NPs主要在小腸被吸收并進入血液，吸入的NPs聚集到肺，然后進入肺毛細血管[7-8]。之后，NPs通過血液循環分布并積累到全身各個器官，甚至通過血腦屏障、胎盤屏障等，其中，肝臟是NPs體內積累的最主要靶器官[9]。肝臟對人類健康有重要維護作用，是人體最主要的代謝及解毒器官，但是，NPs積累到肝臟后，可引起肝細胞毒性、脂質過氧化反應、慢性炎癥等，而慢性肝臟炎癥的持續進展和惡性轉化可以導致肝癌發生。因此，NPs對肝細胞及肝臟的損傷及毒性研究成為評價納米顆粒安全性的重點。

1 納米顆粒對肝臟毒性效應

使用最為廣泛的顆粒如納米銀、納米二氧化鈦、納米氧化銅等是近年來研究NPs對肝臟毒性效應的重點，已有大量研究證實，這些顆粒能產生明顯肝臟毒性，引起肝酶升高、肝臟炎癥以及肝組織壞死等。

1.1 誘發肝臟炎癥

NPs誘發肝臟炎癥可能與促炎因子表達升高相關。實驗發現，雄性Wistar大鼠以氣管滴注的方法每周兩次暴露于0.24 mg/kg納米氧化鎳中，持續6周后出現肝臟炎癥，進一步分析發現，納米氧化鎳明顯增加了肝臟中促炎細胞因子IL-1β和IL-6的濃度，但降低了抗炎細胞因子IL-4和IL-10的水平[10]。而另一個研究選用直徑1 nm和8 nm的納米鉑給小鼠進行靜脈注射，發現1 nm的納米鉑在給藥后3和6 h均顯著誘導了IL-1β和IL-6的產生，肝臟出現炎癥，相較而言，8 nm的納米鉑即使在20 mg/kg下也未對小鼠產生明顯毒性[11]。

含有NPs的材料也同樣可能引起肝臟損傷。Saber等[12]研究證實，給小鼠氣管滴注含多壁碳納米管的環氧樹脂復合材料機械磨損產生的粉塵溶液會引起小鼠肝臟炎癥和壞死等組織病理學改變，但是暴露在不含多壁碳納米管的環氧樹脂粉塵溶液中的小鼠中未觀察到肝臟的損傷。

1.2 引起肝臟損傷

NPs還可引起肝臟損傷。Alarifi等[13]通過腹膜內注射50 nm的納米二氧化鈦后，在小鼠肝臟中觀察到肝臟組織學變化以及堿性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP)和谷草轉氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)水平的增加，指示肝功能受損嚴重。用聲輻射力脈沖成像讀取肝臟剪切波速(shear wave velocity，SWV)值并檢測血清丙氨酸轉氨酶(glutamic pyruvic transaminase，ALT)，發現吸入二氧化硅納米顆粒能增加SWV和ALT值，誘導大鼠肝損傷[14]。雄性Wistar大鼠通過每周氣管內滴注納米氧化鎳(0.015、0.06和0.24 mg/kg)兩次，結果顯示，納米氧化鎳暴露后，ALT、天冬氨酸轉氨酶、ALP和γ-谷氨酰轉肽酶升高，肝細胞水腫，肝竇消失，嗜中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，肝臟損傷嚴重[10]。小鼠暴露于200 mg/kg納米氧化鋅90 d 可造成肝臟損傷，包括局灶性肝細胞壞死、中央靜脈充血擴張、ALT和天冬氨酸轉氨酶水平顯著升高[15]。

1.3 改變肝臟結構及功能

NPs還可引起肝臟結構及功能改變。此外，Sun等[16]將斑馬魚胚胎暴露在50 mg/L的納米氧化銅下4 h后，發現納米氧化銅可引起肝毒性，同時斑馬魚胚胎暴露于高劑量的納米氧化銅中會導致肝臟發育不良。Vesterdal等[17]給Zucker大鼠經口灌胃6.4 mg/kg 的碳黑后，大鼠肝臟的脂質負荷增加，研究認為碳黑暴露與肝脂肪變性有關。Almansour等[18]將雄性Wistar白化大鼠暴露于納米氧化鋅中(每日暴露劑量為2 mg/kg)，持續21 d后取大鼠的肝臟活組織進行組織病理學檢查，他們發現，與對照組大鼠相比，暴露于納米氧化鋅的大鼠肝組織中出現竇狀擴張、小葉和門靜脈三支血管炎性細胞浸潤、肝組織壞死、水樣變性等。

此外，當機體存在慢性肝病如酒精性肝病、脂肪肝等情況下接觸納米顆粒，更易導致肝臟損傷加劇。有研究用不會引起正常小鼠肝組織毒性的納米銀濃度處理超重小鼠時，納米銀易促使小鼠的脂肪肝發展為脂肪性肝炎，該研究還發現納米銀會進一步抑制脂肪酸氧化，誘導并增加小鼠肝臟炎癥[19]。Kermanizadeh等[20]將乙醇預處理小鼠暴露于納米銀后，小鼠的肝臟炎癥和肝臟病變程度惡化，另外，該研究還發現乙醇影響了肝臟受NPs攻擊后的恢復能力。

2 納米顆粒毒性效應的可能機制

NPs通過產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)、誘導DNA損傷、損傷細胞膜、改變基因組甲基化等毒性機制，誘導肝臟毒性，對肝細胞及肝臟組織產生損傷，最終影響肝臟正常功能，打破機體健康。其中，研究普遍認為，NPs表現出毒性作用的主要機制是產生過量ROS，最終誘導細胞發生氧化損傷，而近年來研究也發現，除了產生ROS，NPs也可直接破壞細胞膜、擾亂基因表達等引起肝細胞和組織壞死。

2.1 產生ROS

NPs可通過三方面誘導ROS的產生。其一，部分NPs表面如納米二氧化硅有促氧化功能團，當與胞內氧化劑結合后可直接產生ROS；其二，當NPs進入細胞的線粒體后，它們會損傷電子傳遞鏈、引起線粒體膜的去極化，而受損線粒體則會產生大量ROS；其三，NPs進入細胞中會激活包括巨噬細胞和嗜中性粒細胞在內的免疫細胞，活化的免疫細胞則會增加ROS的產生[21]。由NPs誘導的胞內過量 ROS 生成及其引起的胞內氧化應激反應正是導致細胞、組織損傷甚至細胞死亡的主要原因之一。其中，ROS可與DNA發生反應，導致DNA氧化，DNA鏈斷裂，形成DNA損傷的生物標志物即8-氧代-7，8-二氫-2 -脫氧鳥苷 (8-oxo-7，8-dihydro-2 -deoxyguanosine) ，并誘導微核形成，產生明顯遺傳毒性[22]，也可與脂質發生反應，形成脂質過氧化物，破壞及損傷生物大分子，影響細胞功能。

2.2 損傷細胞膜

NPs可直接(物理損傷)或間接(氧化損傷)破壞細胞膜結構及活性，導致細胞死亡。Salatin等[23]發現，帶正電荷的NPs能增加與帶負電荷的細胞膜的相互作用，從而增加細胞吞噬作用，破壞細胞膜功能。此外，NPs還可通過產生脂質過氧化來影響細胞膜完整性和功能穩定[24]。

2.3 形成蛋白質電暈

NPs進入生物環境中導致帶負電荷的蛋白質吸附在帶正電荷的顆粒上，形成蛋白質電暈(protein corona)。蛋白質電暈會改變NPs的尺寸、聚集狀態以及表面性質，也會影響細胞對NPs的攝取[25]，此外，胞內蛋白質也因吸附帶電納米顆粒而改變其分子構象及折疊，最終失活。研究發現，吸附在超順磁性納米氧化鐵上時，轉鐵蛋白會因構象修飾而失活[26]。另外，納米二氧化鈦對磷酸鹽基團具有高度親和力，它會結合蛋白質的磷酸化形式，干擾涉及磷酸化-去磷酸化反應的細胞過程，比如在細胞信號傳導過程中的級聯放大反應，有研究猜想這可能是納米二氧化鈦損傷如DNA修復過程等細胞內信號通路的一種方式[27]。

2.4 改變基因組甲基化狀態

NPs可通過改變DNA甲基轉移酶表達及活性，影響DNA甲基化水平，從而影響全基因組表觀遺傳修飾，這可能在NPs致癌過程中起重要作用。Mytych等[28]發現納米金剛石能促使DNA甲基轉移酶表達上調，引起癌細胞基因組高甲基化。Bai等[29]研究亦表明，納米二氧化鈦會增加DNA甲基轉移酶活性，從而引起DNA修復蛋白啟動子甲基化異常。

3 減少納米顆粒產生肝臟毒性的策略

基于NPs最主要毒性是產生ROS，近來，部分研究也著力于找出可有效代謝、控制ROS的抗氧化劑，以對NPs引起的肝臟毒性起到緩解作用。Niu等[30]發現，葡萄籽原花青素提取物(grape seed procyanidin extract，GSPE)可以劑量依賴的方式降低暴露在納米二氧化鈦中小鼠細胞的DNA損傷、ROS生成及丙二醛積累，有效阻止了小鼠暴露于納米二氧化鈦下肝的組織病理學和生物標志物的改變。Azim等[31]發現口服納米二氧化鈦導致MDA水平升高，小鼠肝臟谷胱甘肽表達降低，DNA損傷明顯，而在納米二氧化鈦暴露后1個月，肌鈦和維生素E的組合口服治療，可減弱小鼠肝臟的毒性作用。

Sonane等[32]研究發現，納米二氧化鈦和氧化鋅可誘導產生ROS并提高秀麗線蟲致死率，但姜黃素和維生素C可在納米顆粒存在的情況下提高線蟲生存率，降低ROS的產生。該研究也提出將姜黃素和維生素C并入日常飲食可避免納米毒性，抗氧化劑的膳食補充在對抗NPs的毒性以及致死性方面非常有效，并可提供機體抵抗進一步暴露的能力。

4 展望

目前，NPs毒性研究已逐漸深入，研究者們試圖從不同層面來解析NPs的致毒機制，以便更好對各種納米材料進行安全性評價。NPs引起的氧化損傷容易導致組織發生炎癥，而人類及環境的NPs暴露濃度較低，往往不能在短期出現急性損傷，但容易產生慢性炎癥，因此，NPs對肝臟毒性的評估也應把長期低劑量暴露考慮在內。此外，檢測、靶向、治療且不產生副作用的納米腫瘤學方面的研究也正在興起，NPs由于尺寸小，可進入到機體任何細胞當中，有研究也發現，納米銀、納米金及納米銀/金混合物可在二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)誘導的肝癌中起到保肝活性，它們可特異性殺死肝癌細胞，對肝癌有潛在的抗癌活性，但不影響動物的體質量，因此，研究也認為納米銀和納米金可能具備有效納米藥物開發的潛力[33]。這項研究給我們以啟示，如果確定某種NPs可定向損傷某類細胞群體，將會極大推進腫瘤靶向治療。最后，在日常飲食中使用抗氧化劑作為減緩納米毒性的方法還需進行大量研究，以便在目前尚不能對NPs進行準確的安全性評價的情況下，我們可通過簡單有效的方法避免NPs引起的慢性炎癥，降低退行性疾病發生風險。