釀造醬油回收油脂的酶法脫酸工藝研究

朱新貴，李學偉，王 穎

（1.華南農業大學 食品學院，廣東 廣州 510642；2.李錦記（新會）食品有限公司，廣東 江門 529156）

釀造醬油是由大豆或豆粕、小麥粉及其制品、麩皮等經微生物發酵后而成。在以全大豆為原料的傳統醬油釀造工藝中，大豆油脂中60%為不飽和脂肪酸[1]，根據油脂的一般氧化機理，油脂受氧、水、光、熱、微生物等的作用，會逐漸水解或氧化而變質酸敗。因此，醬油釀造過程的油脂經過氧化反應，雖然有小部分脂質成分經轉化形成醬油良好的風味成分，但油脂在醬油釀造完成后大部分以脂溶性物質形式殘留在醬油渣中，由于不飽和脂肪酸含量高，這些脂溶性成分極易氧化酸敗，產生自由基并裂變成氧化產物，感官指標最明顯變化的是出現蛤喇味[2-6]。油脂在發酵過程中會發生長期變質反應[7]，導致游離脂肪酸和過氧化物含量高，給醬油渣的利用帶來困難[8-9]。以全大豆為主要蛋白質原料釀造的傳統醬油，其壓榨提取醬油后剩余醬油渣中油脂的含量非常高，達到36.5%～47.17%（干基）[10-12]。

目前我國每年用于釀造醬油所消耗的全大豆約為50萬t，如按油脂含量18%估算，則約9萬t以上油脂被浪費。已有研究表明，全大豆釀造醬油剩余的醬油渣中油脂過氧化值和酸價非常高，分別為2.26 mmol/kg和51.51（KOH）mg/g[13]，由于大量氧化產物及游離脂肪酸的存在，導致回收油脂的營養價值下降，降低了其利用價值。在現代醬油生產工序中，很多企業均應用重壓壓榨工藝對醬醪進行壓榨取醬油，因全大豆具有非常高的油脂含量，醬醪經過壓榨工序抽取醬油時，也附帶出部分深度氧化的回收油脂。由于回收油脂的產量非常大，而且酸價非常高，如何合理處理和利用醬油釀造回收的油脂已成為醬油行業迫切需要解決的問題。脂肪酶是重要的工業酶制劑品種之一，可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應。脂肪酶Novezym435是屬于酯合成酶，能催化甘油、甘油一酯和甘油二酯與游離脂肪酸反應形成甘油酯。因此，本研究為了去除回收油脂中的游離脂肪酸，達到降低油脂酸價的目的，擬采用脂肪酶對釀造醬油回收的油脂進行酶法脫酸處理，結合大豆油脂的理化指標和脂肪酸組成的對比分析，旨在為釀造醬油回收油脂的綜合利用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀造醬油回收油脂：李錦記（新會）食品有限公司；脂肪酶Novezym435（酶活9 000 PLU/g）：諾維信（中國）生物技術有限公司。

甘油、氫氧化鉀、體積分數95%乙醇、冰乙酸、氯仿、甲醇、乙醚、石油醚（30～60℃）（均為分析純）：中國醫藥集團（上海）化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；RE52-99旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；PHS-3C精密pH計：上海雷磁儀器廠；DGG-9620AD電熱恒溫鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；SPH-2102CS恒溫培養振蕩器：上海世平實驗設備有限公司；RE52-99旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；7820A-5977B氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 釀造醬油回收油脂的制備和理化性質的測定

釀造醬油回收油脂的制備：全大豆醬油釀造結束后，醬油醬醪經過重力壓榨工序壓榨醬油時，醬油渣中部分油脂隨著醬油一起被壓榨出來，經碟式離心機分離設備對“液體醬油-油脂”混合物進行分離，然后對油脂進行回收。

回收油脂的理化性質分析：對釀造醬油回收油脂的相對密度、不皂化物含量、皂化值、過氧化值、碘值等理化性質進行測定。

1.3.2 釀造醬油回收油脂的脫酸工藝優化單因素試驗

稱取一定量的釀造醬油回收油脂，應用脂肪酶酶法脫酸的處理方法，分別在不同的反應時間、甘油添加量、脂肪酶添加量和反應溫度條件下，進行脫除游離脂肪酸的處理。以油脂的脫酸率（脫除游離脂肪酸的效率）為評價指標，優化脫酸工藝，其計算公式如下：

反應時間的確定：取100 g釀造醬油回收油脂，在甘油添加量為3.3%，脂肪酸酶添加量為1%，反應溫度為50℃的條件下，振蕩轉速為200 r/min進行反應，反應時間分別為1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h和16 h，測定各個時間段油脂酸價變化。

甘油添加量的確定：取100 g釀造醬油回收油脂，在甘油添加量為0、1.6%、3.3%、4.9%和6.6%，在脂肪酸酶添加量為1%，反應溫度為50℃，反應時間為12 h的條件下，振蕩轉速為200 r/min進行反應，測定不同甘油添加量條件下油脂酸價變化。

脂肪酶添加量的確定：取100 g釀造醬油回收油脂，在甘油添加量為3.3%，在脂肪酸酶添加量為1%、2%、3%和4%，反應溫度為50℃，反應時間為12 h的條件下，振蕩轉速為200 r/min進行反應，測定不同脂肪酶添加量條件下油脂酸價變化。

反應溫度的確定：取100 g釀造醬油回收油脂，在甘油添加量為4.9%，在脂肪酸酶添加量為2%，反應時間為12 h，反應溫度為45℃、50℃、55℃和60℃的條件下，振蕩轉速為200r/min進行反應，測定不同反應溫度條件下油脂酸價變化。

1.3.3 釀造醬油回收油脂脫酸工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以油脂的脫酸率為評價指標優化脫酸工藝，選取反應溫度（A）、反應時間（B）、甘油添加量（C）、脂肪酶添加量（D）4個因素設計L9（34）正交試驗，因素與水平見表1。

表1 回收油脂脫酸工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for deacidification process optimization of the recovered oil

1.3.4 釀造醬油回收油脂理化指標檢測

酸價的測定參考GB 5009.229—2016《食品中酸價的測定》標準中第三法測定酸價的測定；過氧化值的測定參照GB5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》；相對密度的測定參照GB/T 5518—2008《糧食、油料相對密度的測定》；水分及揮發物的測定參照GB 5009.236—2016《動植物油脂水分及揮發物的測定》；皂化值的測定參照GB/T5534—2008《動植物油脂皂化值的測定》；碘值的測定參照GB/T5532—2008《動植物油脂碘值的測定》。

1.3.5 釀造醬油回收油脂的脂肪酸組成分析

釀造醬油回收油脂的脂肪酸甲酯制備：參考GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》。脂肪酸組成的分析采用氣相-質譜聯用法（GC-MS）進行檢測。

色譜條件：安捷倫HP-5毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度280 ℃；分流比10∶1；程序升溫：柱溫60℃，保持1 min，以8℃/min程序升溫至120℃，保持0 min，以8℃/min程序升溫至220℃，保持0 min，以4℃/min程序升溫至250℃，保持2min；氦氣流速1.0mL/min，進樣量1.0μL。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，電子倍增器電壓857 V，接口溫度250℃，離子源溫度230℃，SCAN掃描方式，質量掃描范圍50～400amu。

定性定量方法：查閱美國國家標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）標準譜庫進行定性，峰面積歸一法進行定量分析。

1.3.6 脂肪酶Novozyme435的脫酸穩定性試驗

脂肪酶Novezym435在釀造醬油回收油脂中的最優脫酸工藝條件下，脂肪酶在該反應體系中循環使用至第20批次，測定每批次的脫酸率，考察脂肪酶Novezym435的脫酸穩定性。

1.3.7 數據分析

正交試驗數據采用SPSS統計軟件處理，其結果以平均值表示。

2 結果與分析

2.1 釀造醬油回收油脂理化性質分析

大豆醬油釀造結束后，醬油醬醪經過重力壓榨工序壓榨醬油時，醬油渣中部分油脂隨著醬油一起被壓榨出來，后經碟式離心機分離對油脂進行回收，油脂回收率占醬油的3.5%左右。根據油脂的酸價、過氧化值、相對密度、皂化值、碘值等檢測方法，對釀造醬油回收油脂的理化性質進行測定，檢測數據與GB/T 1535—2017《大豆油》和GB 2716—2018《食品安全國家標準植物油》進行比較，結果見表2。

表2 回收油脂的理化性質檢測結果Table 2 Determination results of physicochemical properties of the recovered oil

由表2可知，釀造醬油回收油脂相對密度、皂化值、過氧化值、碘值都在大豆油國家標準的范圍內。但釀造醬油回收油脂色澤深呈深紅棕色，水分及揮發物含量非常高，尤其酸價高達64.68（KOH）mg/g。

根據油脂的一般氧化機理，油脂受氧、水、光、熱、微生物等條件的作用，會逐漸水解或氧化而變質酸敗，使中性脂肪分解為甘油和脂肪酸，或使脂肪酸中的不飽和鏈斷開形成過氧化物，再依次分解為低級脂肪酸、醛類、酮類等物質[2，14]。

油脂酸敗的作用機制有水解酸敗和氧化酸敗，水解酸敗的程度用游離脂肪酸含量和酸價來衡量，氧化酸敗的程度則用過氧化值或硫代巴比妥酸值（thiobarbituric acid，TBA）來衡量[15]。結果表明，回收油脂的酸價非常高，說明醬油渣中的油脂發生了嚴重的水解酸敗，油脂被分解產生大量的游離脂肪酸；油脂的水解酸敗和氧化酸敗是同時存在，但回收油脂的過氧化值和碘值卻不高，說明醬醪中油脂氧化產生的過氧化物、醛和酮等物質因其親水性的特點，在醬油釀造過程中可能較多地溶于液體醬油，“液體醬油-油脂”混合物經分離設備處理后，溶于油脂中的氧化物質相應較少，導致油脂的過氧化值和碘值的測定值偏低。因此該釀造醬油回收油脂的過氧化值和碘值并不能真實反映油脂的氧化酸敗。由于釀造醬油回收油脂的酸價非常高，因此需要對回收油脂進行脫酸處理，使其滿足GB2716—2018《食品安全國家標準植物油》標準中對植物油酸價的要求。

2.2 釀造醬油回收油脂的主要脂肪酸組成分析

通過氣相-質譜法（GC-MS）分析釀造醬油回收油脂的主要脂肪酸組成，并以國標GB/T 1535—2017《大豆油》中的指標進行對比分析，其總離子流色譜圖結果見圖1，釀造醬油回收油脂中主要脂肪酸檢測結果見表3。

圖1 GC-MS測定回收油脂中脂肪酸組成的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of fatty acids composition of the recovered oil analyzed by GC-MS

由圖1可以看出，釀造醬油回收油脂中的脂肪酸具有較高的分離效果，峰形良好。

表3 回收油脂的主要脂肪酸組成檢測結果Table 3 Determination results of main fatty acids composition of the recovered oil

由表3可知，釀造醬油回收油脂的亞油酸含量比較高，接近脂肪酸總含量的1/2，油酸含量接近1/4，棕櫚酸和硬脂酸含量較少。此外，飽和脂肪酸占15.40%，不飽和脂肪酸占83.00%。與國標中的大豆油相比，回收油脂的脂肪酸組成基本在要求范圍。因此，脫酸處理后的釀造醬油回收油脂具有非常高的利用價值。

2.3 釀造醬油回收油脂酶法脫酸工藝優化單因素試驗

2.3.1 不同反應時間對釀造醬油回收油脂脫酸的影響

取100 g釀造醬油回收油脂，在甘油添加量為3.3%，脂肪酸酶添加量為1%，反應溫度為50℃的條件下，反應時間分別為1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h和16 h，測定各個時間段的油脂酸價變化，結果見圖2。

圖2 不同反應時間對回收油脂脫酸的影響Fig.2 Effect of different reaction time on deacidification of the recovered oil

由圖2可知，隨著酶法脫酸反應時間增加，油脂中的酸價呈下降趨勢。反應前4 h，脫酸的速度最快，油脂中的酸價在2 h時下降至31.73（KOH）mg/g，4 h時的酸價已降到23.6（KOH）mg/g。當反應時間＞4 h后，酸價下降的速度明顯減緩，12 h后酸價趨于平緩，達到20.39（KOH）mg/g，14 h和16 h的酸價分別為20.14（KOH）mg/g和19.95（KOH）mg/g，較12 h時的酸價幾乎無變化。因此，本試驗選擇12 h作為脫酸反應的最適反應時間。

2.3.2 甘油添加量對釀造醬油回收油脂脫酸的影響

取100 g釀造醬油回收油脂，在甘油添加量為0、1.6%、3.3%、4.9%和6.6%，在脂肪酸酶添加量為1%，反應溫度為50℃，反應時間為12 h的條件下，測定不同甘油添加量的條件下的油脂酸價變化，結果見圖3。

圖3 不同甘油添加量對回收油脂脫酸的影響Fig.3 Effect of different glycerol addition on deacidification of the recovered oil

由圖3可知，甘油添加量對釀造醬油回收油脂脫酸效果的影響非常明顯。由于甘油和游離脂肪酸是脂肪酶的反應底物，因此在沒有添加甘油時，在酶的作用下游離脂肪酸只是與釀造醬油回收油脂中的部分甘二酯或單甘酯反應甘油三酯，由于甘二酯或單甘酯含量較低，因此酶促反應消耗的游離脂肪酸較少，導致游離脂肪酸的含量下降非常小。而添加甘油后，游離脂肪酸在脂肪酶的作用下，與甘油進行反應生成甘油酯，因此游離脂肪酸含量下降顯著。

選取酶法脫酸的終止反應時間為12h，當甘油添加量為1.6%、3.3%、4.9%、6.6%時，回收油脂的酸價由64.68（KOH）mg/g分別下降至31.70（KOH）mg/g、20.39（KOH）mg/g、9.1（KOH）mg/g、8.05（KOH）mg/g，脫酸率分別達到51.0%、68.5%、85.9%、87.5%。在設定范圍內，隨著甘油添加量的增加，油脂中的酸價呈下降趨勢，但當甘油添加量達到4.9%時，回收油脂的酸價為9.1（KOH）mg/g，脫酸率最高為85.9%。因此，本實驗選取甘油最適添加量為4.9%。

2.3.3 脂肪酶添加量對釀造醬油回收油脂脫酸的影響

取100 g釀造醬油回收油脂，在甘油添加量為3.3%，在脂肪酸酶添加量為1%、2%、3%和4%，反應溫度為50℃，反應時間為12 h的條件下，測定不同脂肪酶添加量的條件下的油脂酸價變化，結果見圖4。

圖4 不同脂肪酶添加量對回收油脂脫酸的影響Fig.4 Effect of different lipase addition on deacidification of the recovered oil

由圖4可知，隨著脂肪酶添加量的增加，釀造醬油回收油脂的酸價呈下降趨勢。選取酶法脫酸的終止反應時間為12h，當脂肪酶添加量為1%、2%、3%和4%時，回收油脂的酸價由64.68（KOH）mg/g分別下降至9.10（KOH）mg/g、2.77（KOH）mg/g、2.81（KOH）mg/g、3.31（KOH）mg/g，脫酸率分別約85.9%、95.7%、95.6%、94.9%，表明釀造醬油回收油脂的酶法脫酸效果顯著，其中脂肪酶添加量為2%時，酸價最低為2.77（KOH）mg/g，脫酸率最高為、95.7%。因此，本實驗選取脂肪酶最適添加量為2%。

2.3.4 不同反應溫度對釀造醬油回收油脂脫酸的影響

酶是一種生物催化劑，具有一定的溫度適用范圍，溫度過低或過高均降低酶活力，甚至高溫使酶蛋白變性，導致酶失活。取100g釀造醬油回收油脂，在甘油添加量為4.9%，在脂肪酸酶添加量為2%，反應時間為12 h，反應溫度為45℃、50℃、55℃和60℃的條件下，測定不同反應溫度的條件下的油脂酸價變化，結果見圖5。

圖5 不同反應溫度對釀造醬油回收油脂脫酸的影響Fig.5 Effect of different reaction temperature on deacidification of the recovered oil

由圖5可知，選取酶法脫酸的終止反應時間為12 h，隨著溫度的升高，回收油脂的酸價快速下降，脂肪酸酶在反應溫度為50～55℃條件下具有較好的反應活性。當反應溫度為50℃時，回收油脂的酸價最低為2.74（KOH）mg/g，表明釀造醬油回收油脂的酶法脫酸效果顯著。因此，本試驗選取脂肪酸酶的最適反應溫度是50℃。

2.4 釀造醬油回收油脂的酶法脫酸工藝優化正交試驗

根據單因素結果，以油脂的脫酸率為評價指標，選取反應時間（A）、反應溫度（B）、固定化酶添加量（C）、甘油添加量（D）4個因素設計了L9（34）正交試驗，優化脫酸工藝，正交試驗結果與分析見表4。

由表4的極差分析可知，影響因素的主次順序為甘油添加量＞酶添加量＞反應溫度＞反應時間。釀造醬油回收油脂的酶法脫酸的最佳工藝條件為A2B2C3D3，即反應時間為12 h，反應溫度為50℃，甘油添加量為6.6%，脂肪酶添加量為3%。在此最佳工藝條件下進行3次驗證試驗，脫酸率為93.75%。在該工藝條件下，釀造醬油回收油脂的酸價可降低至2.86（KOH）mg/g，符合GB2716—2018《食品安全國家標準植物油》中關于酸價的指標的要求（≤3（KOH）mg/g）。

表4 回收油脂脫酸工藝優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for deacidification process optimization of the recovered oil

2.5 脂肪酶Novozyme435的脫酸穩定性試驗

在酶法脫酸體系中，脂肪酶Novozyme435能催化甘油、甘油一酯和甘油二酯與游離脂肪酸反應形成甘油酯，從而去除油中的游離脂肪酸，達到降低油脂酸價、增加中性油含量的目的。由于酶促反應成本高，因此需要脂肪酶具有連續催化的脫酸穩定性[16-17]。在最佳脫酸工藝條件下，脂肪酶Novozyme435的脫酸穩定性結果見圖6。

圖6 脂肪酶Novozym 435的脫酸穩定性測試結果Fig.6 Results of stability tests of lipase Novezym 435

由圖6可知，固定化脂肪酶Novezym435在該反應體系中循環使用至第20批次時，其脫酸能力沒有發生明顯下降，脫酸率仍達到91.23%左右。說明該脂肪酶Novozyme435具有良好的脫酸穩定性。

3 結論

全大豆釀造醬油經過壓榨工序抽取醬油時，可回收部分深紅棕色的大豆油脂，由于油脂氧化和酸敗形成的大量游離脂肪酸，導致回收油脂的酸價高達64.68（KOH）mg/g，通過氣相色譜-質譜法（GC-MS）分析，釀造醬油回收油脂的主要脂肪酸組成基本在大豆油國標的要求范圍。因此，回收油脂需要進行脫酸處理后才具有開發利用價值。

通過正交試驗設計研究釀造醬油回收油脂的酶法脫酸工藝，最佳的酶法脫酸條件：反應時間12 h，反應溫度50℃，甘油添加量6.6%，脂肪酶添加量3%。在該工藝條件下，釀造醬油回收油脂的脫酸率高達93.75%，油脂的酸價可降低至2.86（KOH）mg/g，低于GB 2716—2018《食品安全國家標準植物油》中食用植物油關于酸價的最高指標要求（≤3 mg/g）。進一步研究表明，在該脫酸反應體系中，固定化脂肪酶Novezym435具有良好的脫酸穩定性。