不同菌種發酵對巴戟天活性成分含量的影響

譚麗容，代文豪，羅志鋒，李文治，黎 攀，林微微，程 敏*，杜 冰

（1.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510623；2.華南農業大學 食品學院，廣東 廣州 510642）

巴戟天（Morinda officinalisHow.）來源于茜草科巴戟屬植物巴戟天的干燥根，主要成分包括多糖及寡糖、蒽醌、水晶蘭苷、有機酸等化合物及無機元素，是我國著名的四大南藥之一[1]，具有補腎壯陽、提高細胞免疫功能等功效[2-3]。炮制作為巴戟天入藥前必須經過的工序，主要有鹽制巴戟天、發酵法炮制、蒸制巴戟天、甘草水制巴戟天（制巴戟天）、煮制巴戟天，目前巴戟天的炮制研究主要集中在鹽制及甘草水制方面。對于各類炮制品的質量和工藝，目前行業尚未定制統一標準，這阻礙了炮制品的研發和生產等[4-5]。

發酵法炮制中草藥是中藥炮制方法之一，是中草藥通過微生物發酵，借助于酶和微生物的作用改變中草藥原有的性質藥效等，進而增強原有功效或產生新的功效，擴大中草藥原有的用藥品種，以適應臨床用藥的需要[6]。目前，國內外有關巴戟天發酵法炮制鮮有文獻報道，只有一篇論文報道了巴戟天發酵炮制的研究，其利用酵母菌發酵巴戟天提高了巴戟天多糖的含量[7]。因此，本研究在篩選適合巴戟天發酵炮制菌種的基礎上，研究發酵炮制過程中活性成分的變化，旨在為發酵法炮制巴戟天的研究開拓新的領域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

工廠巴戟天（抽芯干燥巴戟天（MorindaofficinalisHow.）：廣東省云浮市郁南縣大方鎮巴戟天市場。

1.1.2 菌種

芽孢桿菌屬（Bacillussp.）DU-106、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）、植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）：華南農業大學新資源食品與功能性原料研究及評價中心保藏，并委托廣州市微生物所制成1×1012CFU/g菌粉，作為實驗室備用；釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）RV171：安琪酵母公司。

1.1.3 試劑

氯仿、甲醇、乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；甲基異茜草素、甲基異茜草素-1-甲醚、寡糖、水晶蘭苷標準品（純度均＞98%）：由本研究室分離純化得到。

1.1.4 培養基

發酵培養基：10 g葡萄糖，10 g NaCl，1 000 mL蒸餾水，115℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；DHP-600電熱恒溫培養箱：北京市永光明醫療儀器廠；YSC-2數控超聲波清洗器：昆山禾創超聲儀器有限公司；VD-650桌上式潔凈式工作臺：蘇州凈化設備有限公司；Ultimate3000高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）儀：美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 鹽制巴戟天

將工廠巴戟天用清水洗凈，去除泥土，瀝干待用。每50 g工廠巴戟天中加入50 mL、2%的NaCl中煮沸60 min，撈出瀝干，于60℃條件下熱風干燥24 h，得鹽制巴戟天。

1.3.2 發酵巴戟天

活化液：分別將0.10 g產乳酸芽孢桿菌DU-106、0.10 g鼠李糖乳桿菌、0.10g植物乳桿菌、0.10g釀酒酵母菌RV171溶于50 mL的2%葡萄糖水中，37℃、160 r/min條件下振蕩混勻活化30 min即為活化液。

發酵：將瀝干待用的巴戟天用清水于100℃煮制20min，在超凈工作臺上將150 g煮制后的巴戟天置于350 mL發酵培養基，分別取1 mL活化液接種于培養基中，搖勻。30℃條件下發酵12 d。取出瀝干，60℃條件下烘干24 h，烘干的樣品粉碎后過2號篩，于4℃保存，得芽孢桿菌DU-106發酵巴戟天、鼠李糖乳桿菌發酵巴戟天、植物乳桿菌發酵巴戟天、釀酒酵母發酵巴戟天。

1.3.3 活性成分的檢測

水分含量測定：采用水分含量測定儀測定水分含量，每個樣品重復3次[8]。

水溶性浸出物測定：精確稱定樣品4 g，按照2010年版《中國藥典》中冷浸法對可溶性浸出物進行測定[9]。

多糖含量測定：精密稱量巴戟天粉末0.200 g于圓底燒瓶中，加入150 mL體積分數為80%的乙醇，80℃條件下水浴加熱2 h，過濾；濾渣加入150 mL體積分數為80%的乙醇，80℃條件下水浴加熱2 h，過濾；濾渣加入150 mL水，100℃水浴加熱2h，過濾，取濾液濃縮，冷卻，定容至100mL。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[10-11]。

游離蒽醌含量測定：精密稱量巴戟天粉末1.0 g置圓底燒瓶中，加入50 mL氯仿，85℃條件下水浴回流1 h后補加20 mL氯仿，繼續回流1 h，過濾，將濾液中的氯仿揮干，加入0.5%醋酸鎂-甲醇溶液溶解，采用0.5%醋酸鎂-甲醇法測定游離蒽醌的含量[12]。

甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素含量測定：精密稱量巴戟天粉末2.000g，加氯仿100mL，85℃回流提取2次，每次2 h，濾液合并，回收氯仿，殘渣加甲醇定容至5 mL容量瓶中，搖勻，以0.22μm微孔濾膜過濾，取濾液，采用HPLC外標法測定濾液中甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素含量[13]。HPLC條件為色譜柱：DiamonsilTMC18（4.6mm×250mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）；梯度洗脫（0～5 min，20%A；5～10 min，20～44%A；10～40 min，44%A；40～50 min，44～95%A；50～55 min，95%A）；流速：1.0mL/min；進樣量：20μL；檢測波長：277nm；柱溫：30℃。

寡糖含量測定：精密稱量巴戟天粉末0.5 g于圓底燒瓶中，精密加入體積分數60%的乙醇50 mL，85℃回流15 min，轉移到具塞錐形瓶中，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）20min，冷卻、稱質量，用體積分數60%的乙醇補足至50mL，于4 000 r/min條件下離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液。采用HPLC外標法測定巴戟天寡糖（D-果糖、D（+）-無水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖）含量[14]。HPLC色譜條件為色譜柱：ZORBAX NH2柱（2500 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈（A）-超純水（B）；梯度洗脫（0～5 min，70%A～85%A；5～15min，85%A～70%A；15～45min，70%A；后運行5min）；流速：1.2 mL/min；進樣量：20 μL；檢測器：蒸發光散射檢測器（evaporative light scattering detector，ELCD）。

水晶蘭苷含量測定：精密稱量巴戟天粉末1.000 g于具塞三角瓶中，加入體積分數80%的甲醇100 mL，15℃條件下冷浸1 h，超聲處理（220 W，55 kHz）1 h，過濾，殘渣加入體積分數80%的甲醇50 mL，再超聲處理30 min，合并提取液，揮干，殘渣加甲醇溶解，并轉移至25 mL容量瓶中，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液采用HPLC外標法測定水晶蘭苷含量[15]。HPLC色譜條件為色譜柱：Kromalsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸水溶液（90∶10，V∶V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：233 nm；檢測時間：15 min；進樣量：5 μL。柱溫：30 ℃。

1.3.4 數據處理與分析

數據采用Office Excel 2016及DPS 7.05軟件進行處理；作圖采用Office Excel 2016及GraphPad Prism 7。

2 結果與分析

2.1 巴戟天水分含量

不同炮制方法對巴戟天水分含量的影響結果見圖1。

由圖1可知，工廠巴戟天水分含量最低（15.21%）；不同菌種發酵的4種巴戟天水分含量都在19%～21%；鹽制巴戟天的水含量較高（26.38%）。鹽制巴戟天的水分含量顯著高于發酵炮制和工廠炮制的巴戟天（P＜0.05），分析原因可能由于鹽煮炮制使得鹽制巴戟天含鹽量較高，貯存時易吸水，導致含水量較高。

圖1 不同炮制方法對巴戟天水分含量的影響Fig.1 Effect of different processing methods on moisture in Morinda officinalisHow.

2.2 巴戟天水溶性浸出物含量

不同炮制方法對巴戟天水溶性浸出物含量的影響結果見圖2。

圖2 不同炮制方法對巴戟天水溶性浸出物含量的影響Fig.2 Effect of different processing methods on water soluble extracts content inMorinda officinalisHow.

由圖2可知，工廠巴戟天和鹽制巴戟天的水溶性浸出物含量都較高，均達到了干質量的86%以上，且無顯著性差異（P＞0.05）；而芽孢桿菌DU-106及乳酸菌發酵后的巴戟天水溶性浸出物含量在55%～62%，且無顯著性差異（P＞0.05）；酵母菌發酵后的巴戟天水溶性浸出物含量最低，為34.67%。說明發酵會顯著降低巴戟天中的水溶性物質（P＜0.05），且酵母消耗最多，而鹽煮炮制巴戟天中可能鹽含量較高，導致水溶性浸出物含量較高。

2.3 巴戟天多糖含量

不同炮制方法對巴戟天多糖含量的影響結果見圖3。

圖3 不同炮制方法對巴戟天多糖含量的影響Fig.3 Effect different processing methods on polysaccharide content inMorinda officinalisHow.

由圖3可知，酵母發酵巴戟天多糖含量最多，為4.03%，較工廠巴戟天（2.91%）提高了38.38%；其次是芽孢桿菌DU-106發酵巴戟天，多糖含量為3.79%，較工廠巴戟天提高了30.09%；鹽制巴戟天和鼠李糖乳桿菌發酵后的巴戟天多糖含量無顯著性差異（P＞0.05），較工廠巴戟天分別提高26.00%和25.39%；植物乳桿菌發酵后的巴戟天多糖含量為3.32%，也能顯著提高巴戟天多糖含量（P＜0.05），較工廠巴戟天提高了14.10%。由此得出，發酵炮制和傳統鹽制相較于工廠巴戟天都能顯著性的提高巴戟天多糖含量（P＜0.05），說明無論是傳統炮制還是發酵炮制，都能顯著提高巴戟天多糖含量（P＜0.05）。

2.4 巴戟天游離蒽醌含量

不同炮制方法對巴戟天游離蒽醌含量的影響結果見圖4。

圖4 不同炮制方法對巴戟天游離蒽醌含量的影響Fig.4 Effect of different processing methods on free anthraquinone content inMorinda officinalisHow.

由圖4可知，相比于未處理的工廠巴戟天（0.024mg/g），除鼠李糖乳桿菌發酵后的巴戟天外，其他炮制方法都顯著提高了巴戟天中游離蒽醌的含量（P＜0.05）。芽孢桿菌DU-106發酵后的巴戟天中游離蒽醌含量最高（0.057 mg/g）；其次是酵母菌發酵后的巴戟天（0.052mg/g），相比于工廠巴戟天分別提高了139.83%、118.71%，且顯著高于傳統鹽制的巴戟天（P＜0.05）；植物乳桿菌發酵后的巴戟天游離蒽醌含量為0.047 mg/g，與鹽制巴戟天無顯著性差異（P＞0.05），相比于工廠巴戟天提高了96.37%。

2.5 巴戟天甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素含量

甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素為巴戟天中主要蒽醌類物質，不同炮制方法對巴戟天甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素含量的影響結果見圖5。

圖5 不同炮制方法對巴戟天甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素含量的影響Fig.5 Effect of different processing methods on rubiadin-1-methylether and rubiadin content inMorinda officinalisHow.

由圖5可知，工廠巴戟天中甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素的含量分別為30.2 mg/kg、9.2 mg/kg；酵母菌發酵后的巴戟天中的甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素含量都最高，分別為38.9 mg/kg和11.1 mg/kg，與游離蒽醌含量（0.057 mg/g）基本符合，較工廠巴戟天均顯著提高（P＜0.05）；其次是芽孢桿菌DU-106發酵后的巴戟天，甲基異茜草素-1-甲醚的含量為30.7 mg/kg，甲基異茜草素含量為10.9 mg/kg，比游離蒽醌含量（0.057 mg/g）低，分析原因可能是發酵后，部分甲基異茜草素-1-甲醚或甲基異茜草素轉化成了其他蒽醌類物質；鹽制巴戟天、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發酵后的巴戟天中甲基異茜草素-1-甲醚含量分別為22.7mg/kg、19.5mg/kg、16.4mg/kg，甲基異茜草素含量分別為6.4 mg/kg、7.1 mg/kg、6.3 mg/kg，均顯著低于工廠巴戟天（P＜0.05）。

2.6 巴戟天水晶蘭苷含量

不同炮制方法對巴戟天水晶蘭苷含量的影響結果見圖6。

由圖6可以看出，鹽制巴戟天中的水晶蘭苷含量最高（23.0 mg/g）；其次是芽孢桿菌DU-106發酵后的巴戟天（19.9 mg/g）；酵母菌發酵后的巴戟天的水晶蘭苷含量為14.3 mg/g；鼠李糖乳桿菌發酵巴戟天和植物乳桿菌發酵巴戟天的水晶蘭苷含量無顯著性差異（P＞0.05），分別達到了10.17 mg/g和8.86 mg/g。相比于工廠巴戟天（5.38 mg/g），4個菌種（芽孢桿菌DU-106、酵母菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌）發酵后的巴戟天中水晶蘭苷分別提高了269.76%、166.59%、89.01%和64.70%。相比于傳統鹽制巴戟天，4個菌種發酵后的巴戟天都沒有達到鹽制巴戟天的水晶蘭苷含量。

圖6 不同炮制方法對巴戟天中水晶蘭苷含量的影響Fig.6 Effect of different processing methods on monotropein content inMorinda officinalisHow.

2.7 巴戟天寡糖含量

不同炮制方法對巴戟天寡糖（D-果糖、D（+）-無水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖）含量的影響結果見圖7。

圖7 不同炮制方法對巴戟天中寡糖含量的影響Fig.7 Effect of different processing methods on oligosaccharide content inMorinda officinalisHow.

由圖7可知，鹽制、芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發酵巴戟天均能顯著提高巴戟天中果糖含量（P＜0.05），果糖含量分別為374.92 mg/g、61.04 mg/g、61.03 mg/g、57.30 mg/g，而酵母菌發酵后的巴戟天未測出果糖，分析原因可能是酵母菌消耗了巴戟天中的果糖；相比于鹽制巴戟天，芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發酵后的巴戟天中的果糖含量都顯著低于傳統鹽制巴戟天（P＜0.05）。以果糖為指標，芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌較為適合發酵炮制巴戟天。

工廠、鹽制、酵母菌發酵后的巴戟天中均未測出葡萄糖，芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發酵后的巴戟天中葡萄糖含量分別為17.79 mg/g、11.90 mg/g和11.82 mg/g。原因可能是芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發酵炮制巴戟天轉化生成了葡萄糖，而酵母菌消耗了葡萄糖，故未測出。以葡萄糖為指標，芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌較為適合發酵炮制巴戟天。

相較于工廠巴戟天（36.16 mg/g），其中3個菌種芽孢桿菌DU-106（12.68 mg/g）、鼠李糖乳桿菌（28.15 mg/g）、植物乳桿菌（29.02 mg/g）、發酵巴戟天均不同程度消耗了巴戟天中的蔗糖（64.92%、22.14%、19.74%），而鹽制巴戟天（102.94 mg/g）提高了蔗糖含量（184.69%），其中植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌消耗較少，而芽孢桿菌DU-106消耗較多，酵母菌全部消耗，說明酵母菌不太適合發酵炮制巴戟天。

4個菌種發酵炮制巴戟天都消耗了1-蔗果三糖，芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發酵后的巴戟天中1-蔗果三糖含量分別為9.89 mg/g、16.24 mg/g、13.33 mg/g，而酵母菌發酵巴戟天中未測出蔗果三糖。相比于工廠巴戟天，DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發酵分別消耗了巴戟天63.12%、39.49%、50.32%的1-蔗果三糖，而酵母菌全部消耗了巴戟天中的蔗果三糖。相比于傳統鹽制巴戟天[16]，4個菌種發酵炮制巴戟天都不能達到鹽制提高蔗果三糖含量的效果。

耐斯糖為《中國藥典》中規定巴戟天質量的特征指標。經炮制后的巴戟天中耐斯糖含量都有所下降。《中國藥典》中規定耐斯糖含量標準是2%，其中酵母菌發酵的巴戟天中耐斯糖含量不達標。相比于工廠巴戟天，芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、酵母菌發酵均顯著降低了巴戟天中的耐斯糖含量（P＜0.05），分別消耗了巴戟天55.30%、43.22%、43.40%和91.77%的耐斯糖。相比于鹽制巴戟天，4個菌種發酵都不能達到傳統鹽制消耗巴戟天耐斯糖較少的效果。由此得出，無論是傳統炮制方法還是發酵炮制方法，巴戟天中的耐斯糖都被不同程度的消耗。

相比于工廠巴戟天，經炮制后的巴戟天中1F-果呋喃糖基耐斯糖含量都有顯著性下降（P＜0.05）。其中芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、酵母菌發酵分別消耗了巴戟天58.83%、52.52%、58.26%、93.36%的1F-果呋喃糖基耐斯糖。相比于鹽制巴戟天，4個菌株中除酵母菌株外，其他3個菌株發酵后的巴戟天中的1F-果呋喃糖基耐斯糖含量都達到了或高于傳統鹽制巴戟天的水平，無顯著性差異（P＞0.05）。由此得出，無論是傳統炮制方法還是發酵炮制方法，都會不同程度的消耗巴戟天中的1F-果呋喃糖基耐斯糖，其中芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌較為合適發酵巴戟天。

通過對巴戟天中6種寡糖的測定，與工廠巴戟天和傳統鹽制巴戟天相比，4個菌種中，芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌較為適合作為發酵巴戟天的菌種，而酵母菌不適合發酵巴戟天。

3 結論

通過比較不同炮制法巴戟天中的各活性成分發現，以工廠巴戟天為對照，傳統腌制法優于發酵法炮制巴戟天；芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌及植物乳桿菌發酵法炮制巴戟天均顯著提高了工廠巴戟天中的水分含量、多糖含量、游離蒽醌總量、水晶蘭苷、果糖、葡萄糖含量（P＜0.05），而不同程度的消耗了工廠巴戟天中的水溶性浸出物、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖，其中酵母菌幾乎全部消耗了巴戟天中的寡糖，芽孢桿菌DU-106優于鼠李糖乳桿菌及植物乳桿菌，更適合發酵炮制巴戟天。