柄藍狀菌原生質體的制備與再生條件優化

張薈蓉，周志義，耿安利

1.武漢工程大學化學與環境工程學院，湖北 武漢 430205；2.武漢工程大學化工與制藥工程學院，湖北 武漢 430205；3.新加坡義安理工學院，新加坡 999002

近年來，絲狀真菌在工業酶方面的研究得到了廣泛應用。柄藍狀菌EMM是絲狀真菌中一株經過誘變的高產纖維素酶菌株，是由本實驗室自主分離得到，其纖維素與半纖維素的產量已經可以達到工業水平［1］。為了更進一步提高纖維素酶的產量，從分子水平上分析菌株的特性，轉化系統的建立成為其研究的第一步［2］。相比于其他受體的轉化體系，絲狀真菌因為存在細胞壁，會導致在轉化時外源基因很難進入［3］。針對絲狀真菌的轉化方法主要有PEG/CaCl2原生質體轉化［4-5］，電擊轉化［6-7］，農桿菌介導轉化［8-9］，基因槍轉化［10］，限制性內切酶介導轉化［11］，其中PEG/CaCl2原生質體轉化法和農桿菌介導轉化法是現在絲狀真菌使用最多的轉化方法［12］。農桿菌介導法雖然受體形式多樣，轉化效率高，但其在轉化過程中會在轉化體系中引入外源片段［13］，并且操作復雜，周期長，轉過過程容易受影響［14］。PEG/CaCl2原生質體方法操作簡單，轉化效率高，整合度高，并且容易得到多拷貝而成為常用的轉化方法［15］。常見的真菌黑曲霉［16］、紅曲霉［17］，Trichoderma viride［18］和絲狀真菌AL18［19］等均采用原生質體的轉化方法，已經建立了良好的轉化體系。PEG/CaCl2原生質體轉化過程中，足夠數量且再生能力強的原生質體的制備是最為重要的部分［20-21］。因不同真菌的細胞壁構造不同，裂解收集原生質體的方式也會不同，因此不同菌種中制備原生質體的方法也需要不斷地探索優化。另外，轉化實驗中原生質體高效的再生能力也是其成功的核心，再生率的提升表明陽性轉化子獲得幾率的提升，因此會提高轉化效率。本課題將分別從材料的選擇，真菌菌齡，滲透壓穩定劑種類，裂解酶酶種類，裂解酶的濃度，酶解時間及原生質體再生方式，對柄藍狀菌EMM原生質的制備與再生進行探索和優化，為后續絲狀真菌EMM在分子水平方面的研究奠定堅實的基礎［22］。

1 實驗部分

1.1 材 料

1.1.1 菌株 柄藍狀菌（Talaromyces stipitatus）EMM是由分離于新加坡的野生菌OPC4-1誘變所得，由本實驗室保存。

1.1.2 酶和試劑 裂解酶（Lysing enzymes from Trichoderma harzianum，Sigma公 司）；蝸 牛 酶（Snailase，上海生物工程有限公司）。溶液1（10 mmol/L Na2HPO4+1.2 mol/L MgSO4，pH 5.8）；溶液 2（0.6 mol/L Sorbitol+0.1 mol/L Tris-HCl，pH 7.0）；溶液 3（1 mol/L Sorbitol+10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）；溶 液 4（1 mol/L Sorbitol+10 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L CaCl2，pH 7.5）；溶液 5（質量分數25%PEG6000+50 mmol/L CaCl2+10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）。

1.1.3 培養基 PDA培養基（Merck公司）；Seed Medium（10 g/L glucose，1 ml/L Tween 80，Fermenta?tion Medium）；PDB培養基（Merck公司）；Spore Medium（30 g/L Solka-floc，Wheat Bran 40 g/L，Agar 15 g/L，Fermentation Medium）。

1.2 方 法

1.2.1 孢子的收集 將一定量的EMM孢子，接種于孢子培養基PDA平板上，30℃的培養箱中培養10 d，等長出足夠量的孢子后，用0.9%NaCl溶液將孢子輕輕洗脫，用雙層的孔徑30 μm尼龍布過濾除去菌絲和培養基等雜質，制備成一定濃度的孢子懸液。

1.2.2 菌絲的收集 從PDA平板上挑取一定量的EMM菌絲，接種到250 mL搖瓶中，搖瓶里含有50 mL種子培養基，將搖瓶放置在28℃培養箱中，120 r/min培養2 d，待長出適量的菌絲后，用雙層的孔徑30 μm尼龍布過濾收集菌絲，并用雙蒸水洗滌2次，以備使用。

1.2.3 酶解液的配制 緩沖液分別用1.2 mol/L MgSO4，0.8 mol/L NaCl，0.8 mol/L蔗糖（Sucrose），以1 mol/L山梨醇（Sorbitol），準備不同濃度的裂解酶（Lysing enzymes from Trichoderma harzianum）、蝸牛酶（Snailase）（表1），0.2 μm濾膜除菌以備使用，酶解液必須現配現用。

表1 復合酶的不同配比組合Tab.1 Different enzyme ratios of compound enzymes

1.2.4 原生質體的收集 制備復合酶酶解液，分別配置成不同的濃度，平板上收集0.2 g孢子和菌絲，8 000 r/min離心，用20 mL溶液1洗滌2次，沉淀用20 mL復合酶酶解液于50 mL的搖瓶中，置于30℃的水浴鍋中以80 r/min的速度震蕩裂解，分別培養1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，用雙層的孔徑30 μm尼龍布過濾收集原生質體。調節離心機溫度為4℃，5 000 r/min離心10 min，用20 mL溶液2洗滌2次，在相同的離心的條件下，再用20 mL溶液3洗滌2次，最后在冰浴條件下加入適量的溶液4懸浮，通過血球計數器計算原生質體的濃度。

1.2.5 原生質體再生條件的探索 將收集到的原生質體用溶液4調節至濃度為1×103/mL，用兩種方式進行再生培養：方式一為在菌絲生長培養基PDA平板上直接鋪板；方式二為在液體再生培養基中培養12 h，然后再與PDA混合涂板，平板均置于30℃培養箱中培養6 d，觀察平板上再生菌落的數目；對照組用無菌水代替溶液4調節原生質體至相同濃度，以相同的培養條件進行再生培養，除去孢子和殘留菌絲造成的誤差。原生質體再生率（%）=［（再生菌落數量-對照菌落數量）/原生質體數量］×100%。

2 結果與討論

2.1 原生質體的形態

細胞在裂解酶的作用下，首先是細胞壁被酶解破碎，然后原生質體從菌絲的尖端開始析出，再慢慢釋放。通常狀態下原生質體會呈透明圓形。在普通光學顯微鏡下，分別觀察酶解前的EMM菌絲和酶解過濾后收集的原生質體的形態并拍照，結果如圖1。

圖1 光學顯微鏡下的EMM：（a）菌絲，（b）原生質體Fig.1 Observation EMM with microscope：（a）mycelium，（b）protoplasts

2.2 原生質體材料選擇對其制備與再生的影響

選擇孢子（Spore）和菌絲（Mycelium）作為原生質體制備材料，比較它們對原生質體制備與再生的影響。如圖2（a）所示，菌絲的尖端更容易產生原生質體，選擇用EMM菌絲作為原生質體制備材料時原生質體的濃度最高（Protoplast concentration 6.23×108/mL）且再生率最高（Regeneration rate 15.6%），因此將EMM菌絲作為其制備材料。

2.3 菌齡及滲透壓穩定劑對原生質體制備與再生的影響

以不同真菌菌齡（Fungal age）12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的菌絲作為原生質體制備材料，以不 同 的 滲 透 壓 1.2 mol/L MgSO4、0.8 mol/L NaCl、0.8 mol/L Sucrose、1 mol/L Sorbitol作為原生質體制備時的滲透壓穩定劑（Osmotic stabilizer），分別比較它們對原生質體制備與再生的影響。結果如圖2（b）所示，細胞壁的成分隨著菌株的生長而發生了變化，導致酶解效率達到一定程度后開始下降，菌種年齡為48 h時原生質體的數量最多（Protoplast concentration 7.74×108/mL），原生質體的再生能力會隨菌種年齡改變，菌種年齡為60 h時原生質體的再生率最高（Regeneration rate 16.8%），但生成的原生質體的數量明顯偏低（Protoplast concentration 5.27×108/mL），綜合考慮原生質體的制備材料選擇用48 h菌齡的EMM菌絲；滲透壓溶液的選擇主要考慮兩個因素，第一是能穩定和保護原生質體的生成，第二是能對酶的酶解效果有促進作用，如圖2（c）所示，雖然1 mol/L Sorbitol作為滲透壓穩定劑時原生質體的再生率最高（Regeneration rate 16.3%），但生成原生質體的數量偏少（Protoplast concentration 4.27×108/mL），而1.2 mol/L MgSO4作為原生質體制備時的滲透壓穩定劑（Osmotic stabilizer）時原生質體的數量最多（Protoplast concentration 6.82×108/mL）且再生率也比較高，綜合考慮選擇1.2 mol/L MgSO4作為原生質體制備時的滲透壓穩定劑。

2.4 酶的種類配比和酶解時間對原生質體制備與再生的影響

以不同酶的種類配比（Enzyme ratio）和酶解時間（Enzymolysis time）分別作為制備原生質體時的酶解條件，比較兩種因素對原生質體制備和再生的影響。選擇合適的酶解條件時需要考慮兩個因素：一是形成原生質體的速度；二是原生質體再生的效率。如圖 2（d）和 2（e）所示，酶的種類配比為B時，原生質體的數量（Protoplast concentration 8.23×108/mL）和再生率（Regeneration rate 15.8%）最為合適，同時酶解時間達到3 h時原生質體的數量則為最多（Protoplast concentration 8.52×108/mL）且再生率最高（Regeneration rate 15.2%）。綜合分析選擇酶的種類配比為B（50 mg/mL的裂解酶），酶解時間為3 h作為原生質體的制備條件。

圖2 對EMM原生質體生成量與再生率的影響：（a）制備材料，（b）菌種年齡，（c）滲透壓穩定劑，（d）酶的種類配比，（e）酶解時間Fig.2 Effects on protoplasts production and regeneration rate of EMM：（a）preparation materials，（b）fungal age，（c）osmotic stabilize，（d）enzyme ratios，（e）enzymolysis time

2.5 不同再生方式對原生質體再生的影響

方式一為在菌絲生長培養基PDA平板上直接鋪板（Direct plating）；方式二為在液體再生培養基中培養12 h，然后再與PDA混合涂板（After hatch?ing），比較兩種方式對原生質體再生率的影響。原生質體若失去細胞壁的支撐與保護，就會變得易破碎和易被感染。如圖3所示，原生質體先在液體再生培養基中孵育12 h恢復細胞壁，再與PDA培養基混合鋪板提高原生質體的再生率，選擇該種方式作為原生質體的再生條件，原生質體的再生率最高（Regeneration rate 17.2%）。 圖4所示，圖4（a）和圖4（b）分別為方式一和方式二條件下原生質體在PDA平板上的生長狀態，因此選擇方式一為原生質體的再生條件。

圖3 原生質體再生方式對EMM原生質體再生率的影響Fig.3 Effects of regeneration methods of protoplasts on protoplasts regeneration rate of EMM

圖4 兩種不同的再生方式得到的原生質體在PDA平板上的生長狀況：（a）直接涂板，（b）先培養后混合涂板Fig.4 Growth conditions of protoplasts on PDA plates：（a）directing plating，（b）after hatching

3 結 語

原生質體的制備與再生是PEG/CaCl2介導的真菌轉化方法的基礎，原生質體的數量與再生能力直接影響轉化效率。本文首次成功建立了柄藍狀菌EMM以PEG/CaCl2介導的轉化體系，從材料選擇，真菌菌齡，滲透壓穩定劑種類，裂解酶種類，裂解酶濃度，酶解時間及原生質體的再生方式，對絲狀真菌柄藍狀菌EMM的原生質制備與再生條件進行探索優化。獲得最佳的原生質的制備與再生條件：制備材料為48 h的菌絲，滲透壓穩定劑為1 mol/L MgSO4，裂解酶濃度為50 mg/mL，酶解溫度為30℃，酶解時間為3 h，再生方式為先孵化培養再混合倒板。在此條件下原生質體的釋放量高達8.73×108/mL，再生率高達17.7%。本實驗所獲得的原生質體的釋放量和再生率均達到了較高的水平，絲狀真菌AL18［18］的原生質體制備率和再生率僅為 1.42×107/mL 和 3.2%；Trichoderma viride［19］的原生質體制備率和再生率為4.7×107/mL和14.5%。相比較而言，本實驗所建立的最適條件已經完全達到了后續轉化實驗的要求，為柄藍狀菌的分子水平研究奠定了良好的基礎。