基質金屬蛋白酶及其基因多態性在缺血性卒中病理過程中的作用

張敏，馬麗，趙詠梅，呂燕敏，龍會登，龐麗娟

卒中是全球死亡和殘疾的主要原因之一。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）9是MMP家族的成員，因其對腦血管基底膜主要成分如Ⅳ型膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白的降解作用，已被證明在腦血管疾病的發生和發展中發揮重要作用[1]。此外，研究證實MMP9還參與了缺血性卒中后腦損傷、再灌注損傷的病理過程。因此，進一步探究MMP9及其基因多態性在缺血性卒中發病、進展及預后中的作用，對缺血性卒中的診療具有重要意義。

1 缺血性卒中后MMP9的表達及來源

缺血性卒中后，MMP9被發現在梗死區腦組織及相關細胞中高表達。動物實驗證實，與假手術小鼠相比，大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）小鼠缺血灶中MMP9顯著增加，并推測MMP9的升高可能與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）升高有關[2-4]。大鼠實驗顯示，在腦局灶性缺血24 h內，梗死區中心及外周的內皮細胞和中性粒細胞表達MMP9，且MMP9活性最高，并在5 d內維持該活性水平。5 d后，可觀察到梗死區巨噬細胞表達MMP9；15 d時，MMP9活性降至基線狀態[5]。也有研究證實，在大鼠發生腦缺血后1～3 d，紋狀體和皮質中央缺血區域內可檢測到MMP9增加，且其主要位于內皮細胞中，在神經元和星形膠質細胞中表達較弱；相反，在卒中后7～14 d，MMP9主要在梗死區周圍皮層的神經元和星形膠質細胞中表達[6]。

使用嵌合體野生型（wild-type，WT）→MMP9敲除（MMP9-/-）小鼠（將WT小鼠的骨髓移植到MMP9-/-小鼠）或MMP9-/-→WT小鼠（MMP9-/-小鼠的骨髓移植到WT小鼠）的研究顯示，MMP9前體（pro-MMP9）僅在WT或WT→MMP9-/-小鼠腦缺血再灌注24 h時強烈升高，活性MMP9在WT小鼠和WT→MMP9-/-嵌合體小鼠中水平相似，考慮野生型小鼠短暫性局灶性腦缺血24 h內的MMP9表達來源于白細胞[7]。有研究將短暫性MCAO（2 h）再灌注小鼠循環血中的中性粒細胞分離后發現，WT小鼠和WT→MMP9-/-嵌合體小鼠可以顯示MMP9前體，但在MMP9-/-和MMP9-/-→WT小鼠的中性粒細胞中卻未發現MMP9前體顯像，提示腦缺血再灌注后MMP9前體來源于中性粒細胞[7]。研究者們進一步發現在中性粒細胞分泌顆粒里含有大量的MMP9前體，而缺血性卒中后這些分泌顆粒釋放并激活MMP9[8-10]。

中性粒細胞釋放MMP9，MMP9反過來可促進中性粒細胞黏附與聚集。與MMP9-/-小鼠相比，短暫性MCAO（2 h）的WT小鼠缺血灶內小靜脈內皮在24 h就出現白細胞黏附，同時中性粒細胞浸潤明顯增加；再灌注8 h和24 h，缺血半球中性粒細胞堵塞毛細血管和實質內中性粒細胞浸潤的程度逐漸增加[7]。

MMP9在缺血性卒中患者中也呈高表達。Anna Rosell等[11]解剖了缺血性卒中（發病5 d內）患者死亡6 h內的新鮮腦組織，發現梗死灶中MMP9前體及激活的MMP9表達較梗死灶周圍組織高，而梗死周圍組織MMP9前體及激活的MMP9表達則高于對側正常腦組織；梗死灶中MMP9主要位于中性粒細胞高表達的血管周圍；梗死灶內MMP9陽性細胞主要為激活的小膠質細胞，而梗死灶周圍MMP9陽性細胞主要為激活的小膠質細胞和中性粒細胞。另外有研究者對發病9 d至5年死亡的缺血性卒中患者進行尸體解剖，但在其腦組織中未檢測到MMP9的表達，提示MMP9主要在缺血性卒中急性期被釋放和激活[12]。

2 缺血性卒中與外周血MMP9水平的關系

Mark A.Reynolds等[13]比較了健康對照組與發病12 h內卒中（出血性和缺血性）患者的血漿MMP9水平，發現急性卒中患者血漿MMP9的水平顯著高于對照組。Solveig Horstmann等[14]測定了50例急性缺血性卒中患者的血清MMP9水平，發現MMP9水平在發病第1天急劇增加，并持續升高至12 d。也有研究顯示，外周血基線MMP9水平升高與缺血性卒中顱腦CT超急性期的征象（與臨床表現相符的局部低密度灶，豆狀核、皮質顯影模糊，皮層溝消失或中線結構移位而導致的占位效應）有關，但與最終的腦梗死體積無關[15]。另有研究顯示，在大腦中動脈閉塞后3 h內接受rt-PA治療的患者，血漿基線MMP9水平與溶栓前的MRI DWI上的病灶體積無關，但與rt-PA治療后第一個24 h內DWI上病灶的增長相關，基線MMP9＞100 ng/mL為DWI病灶增長＞180%的最佳預測點；而且該研究還顯示，基線MMP9水平與缺血性卒中患者溶栓治療前的NIHSS評分無關，但與治療后第一個24 h內較差的NIHSS評分有關，MMP9水平對缺血性卒中超早期腦損傷有獨立預測作用[16]。

雖然目前多數研究證實外周血MMP9表達水平升高增加與缺血性卒中關系密切，但也有臨床研究的結論不一致。一項大型病例對照研究評估了MMP9的遺傳變異與心肌梗死和卒中風險間的關系，結果顯示MMP9單倍型或單核甘酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與心肌梗死和卒中無關[17]。一項包括1308例患者的前瞻性、多中心觀察性研究顯示，血漿MMP9水平在卒中和假卒中患者之間或者在超急性期中缺血性卒中和出血性卒中患者之間并沒有區別[18]。因此，MMP9對缺血性卒中的影響仍需進一步的證據支持。外基質成分和MMP活性蛋白的多功能蛋白，其表達在缺血腦組織中上調，可以增加MMP9 mRNA的表達并激活MMP9[20]。白細胞介素17（interleukin17，IL-17）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）可以通過p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）、細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2依賴的核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）和活化蛋白-1（activated protein，AP-1）誘導MMP9的表達[21-22]。IL-1β則可通過NF-κB、p42/p44MAPK、p38MAPK和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途徑誘導MMP9表達[23]。心血管活性肽（Salusin-β）可通過p65-NF-κB通路促進MMP9的表達，進而導致血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）由血管中膜向內膜遷移及內膜增生[24]。此外，有學者研究發現，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可促進MMP9的表達，且MMP9水平與VEGF水平在缺血性卒中急性期呈正相關[25]。R.D.BELL等[26]發現載脂蛋白E4（apolipoprotein E4，APOE4）的表達可通過激活小鼠周細胞中的促炎親環蛋白A（cyclophilin A，CypA）-NF-κB-MMP9途徑導致血腦屏障分解，而星形膠質細胞分泌的APOE3可通過脂蛋白受體抑制周細胞中CypA-NF-κB-MMP9通路[26]。

3 MMP9參與缺血性卒中病理生理過程的相關通路

MMP9可通過多種途徑被激活或者抑制。在腦缺血時，MMP9可與神經元型一氧化氮合酶共定位，并在體內被S-亞硝基化激活，最終誘導神經細胞凋亡[19]。聚合酶δ-相互作用蛋白2（polymerase δ-interacting protein 2，Poldip2）是一種調節血管細胞

4 MMP9與缺血性卒中出血轉化的關系

基于對細胞外基質的降解作用，MMP9可導致缺血性卒中后出血轉化。在大腦中動脈區心源性卒中患者中，無論有無出血轉化，患者外周血MMP9表達均增加，在后來發展為實質出血的患者中，MMP9的血漿水平顯著升高[27-28]。另有研究者發現，在調整了潛在的危險因素及梗死體積后，外周血MMP9升高（MMP9≥140 ng/mL）與發病24 h內急性缺血性卒中患者出血轉化的發生密切相關。無論是大動脈粥樣硬化型、心源性栓塞型還是不明原因型缺血性卒中，外周血MMP9的高表達均是患者發生出血轉化的獨立預測因素，其預測出血轉化的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為87%，90%，61%和97%[15]。對卒中后5 d內死亡的患者死亡后6 h內進行尸檢，發現MMP9在出血轉化病灶中高表達且其信號強度高于梗死灶及梗死灶周圍[11]。

rt-PA被證實可促進MMP9的表達。動物實驗證實，與對照組相比，rt-PA處理的MCAO小鼠腦組織中MMP9的活性增加[2]。臨床研究發現，相對于沒有出血轉化的患者，發病3 h內rt-PA溶栓并出現治療相關的出血性轉化或實質血腫的急性缺血性卒中患者基線MMP9水平顯著增高[29]。富含于人腦內皮細胞中的低密度脂蛋白受體相關蛋白（low density lipoprotein receptor-related protein，LRP）可通過MMP9基因啟動子中含有的AP-1和NF-κB結合位點介導rt-PA引起的MMP9的上調[30]。rt-PA還可以通過一條獨立于其蛋白水解活性的途徑誘導LRP-1亞基上的快速酪氨酸磷酸化，然后激活MAPK/Erk激酶1及其下游的Erk-1和Erk-2來誘導MMP9的表達[31]。在一項納入了300多例急性缺血性卒中患者（NIHSS中位數為11）的研究中發現，外周血MMP9水平變異[（治療后24 h MMP9-治療前MMP9）/治療前MMP9]與死亡或癥狀性顱內出血獨立相關，且MMP9水平變異與缺血性卒中后3個月的不良功能結局相關（mRS≥3分）；在排除了較輕微的出血轉化患者后，MMP9水平變異與溶栓后癥狀性顱內出血仍密切相關；該研究還顯示，無論是溶栓前、溶栓后24 h還是溶栓后7 d，外周血MMP9水平變異均與較高的NIHSS評分相關[32]。Solveig Horstmann等[14]比較了卒中患者的3個治療亞組：靜脈注射肝素（n=18）組，中度低溫（n=15）組和rt-PA靜脈溶栓（n=17）組，發現外周血MMP9水平在不同治療組顯著不同，其中，溶栓亞組中最高，亞低溫組中最低。MMP9的增加可能與rt-PA介導的中性粒細胞黏附和脫顆粒有關[33]。

5 MMP9基因多態性與缺血性卒中的關系

MMP9的基因多態性rs3918242（-1562 C/T）位點基因多態性，與缺血性卒中的關系也被大量研究所證實，但結果卻不盡相同甚至相反。有研究顯示，相對于MMP9 rs3918242位點的TT基因型，攜帶CC基因型和TC+CC基因型的人群有更高的缺血性卒中的發病風險；且CC基因型和TC+CC基因型與中國缺血性卒中分型（Chinese Ischemic Stroke Subclassification，CISS）中大動脈粥樣硬化亞型的卒中風險相關[34-35]；但另有研究證實，具有rs3918242 T等位基因的缺血性卒中特別是有吸煙史的缺血性卒中患者，血清MMP9水平明顯升高，且較CC基因型者具有更大的梗死面積[35]。卒中患者MMP9 rs3918242位點 T等位基因和CT+TT基因型頻率顯著高于健康人；相對于CC基因型的卒中患者，T等位基因攜帶（CT+TT基因型）的患者更年輕；在校正了年齡、性別、BMI和血脂等混雜因素后，T等位基因和TT基因型與卒中的發生密切相關；而且相較于無2型糖尿病的卒中患者，有2型糖尿病的卒中患者中T等位基因和CT+TT基因型更多見[36]。

一項Meta分析顯示，MMP9 rs3918242位點變異（T等位基因，TT+CT基因型）增加中國人群中缺血性卒中的風險；然而兩者在高加索人群中未檢測到有關聯性[37]。新近發表的一項納入3647例缺血性卒中患者和3685例正常對照的Meta分析也取得了相似的結果[38]。而日本的一項納入3094例2型糖尿病患者的研究顯示，MMP9 rs3918242位點T等位基因與2型糖尿病患者卒中發病率無關；但該研究進一步將與血栓形成和動脈粥樣硬化斑塊破裂相關的4種基因——MMP9 C-1562T、血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）G-1051A、凝血因子Ⅻ（coagulation factor Ⅻ，F12）C-46T、纖溶酶原激活物抑制劑（plasminogen activator inhibitor，PAI-1）6754G/5G按各自的基因多態性分為8組（每位患者攜帶的上述等位基因的數量從0至8），比較基因多態性與卒中的關系后發現，隨著不良等位基因數量的增加，缺血性卒中患病率增加；在調整了性別、年齡、吸煙習慣、BMI、糖尿病患病時間、糖化血紅蛋白、高血壓和血脂異常等因素后，兩者仍顯示有密切聯系；而且與具有3個或更少等位基因的患者相比，具有4個或更多等位基因的患者發生缺血性卒中的風險顯著增加[39]。

有研究證實，MMP9基因型多態性與rt-PA治療后出血轉化無關[40]。J.Montaner等[28]對發病3 h內，責任血管為大腦中動脈并行rt-PA溶栓的缺血性卒中患者進行了研究，結果顯示，MMP9啟動子區C-1562T基因多態性在患者與健康對照組之間或后來發生出血轉化的患者之間無顯著差異。

6 展望和建議

①多種因子和通路均可導致缺血性卒中后MMP9表達的升高，但目前研究的結果和結論存在一定差異甚至矛盾，因此對于相關通路和機制的研究有待于更加深入。②MMP9可來源于白細胞并可促進白細胞的黏附與聚集，導致腦毛細血管堵塞及局部的炎癥反應，調節性T細胞則可降低MMP9的表達，而相關研究證實CD4 T淋巴細胞對動脈粥樣硬化的發生發展有促進作用，CD8 T淋巴細胞則延緩和改善動脈粥樣硬化的形成。淋巴細胞與MMP9的關系有待于進一步研究證實。③血漿MMP9水平及MMP9基因型與缺血性卒中之間的關系有相互矛盾的結果且在不同人種中亦有差異，因此MMP9在更大樣本，更多人種中的研究有待于進一步開展。④基于MMP9對細胞外基質的降解和重塑作用，MMP9及其抑制劑在缺血性卒中后血腦屏障破壞及出血轉化中作用的研究應進一步加強。

目前研究表明MMP9在缺血性卒中發病中具有重要作用。MMP9水平升高與神經元損傷，細胞凋亡，血腦屏障開放，腦水腫，出血性轉化和卒中后再灌注損傷均密切相關[19，27-28，41]。卒中后早期抑制MMP9的表達可以延緩卒中的進展，降低卒中后腦水腫程度及出血轉化的風險及再灌注損傷，減輕神經血管損傷并改善神經功能[42-44]。但也有一些臨床研究顯示MMP9與卒中的發生發展沒有關系[17-18]。因此，MMP9在卒中發病、進展及預后中的作用及其機制需要進一步的證據支持。

【點睛】本文對基質金屬蛋白酶9在缺血性卒中后的激活，參與腦損傷的可能機制，其基因多態性與卒中及卒中后出血轉化的關系研究進行了總結。