Nod樣受體蛋白3炎性小體在腦缺血再灌注損傷中的研究現狀

丁承程，李國忠

Nod樣受體蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體是骨髓源性的巨噬細胞中的固有免疫相關蛋白復合物，除了能夠參與介導、調控多種免疫反應，介導細胞死亡和組織損傷，還促進了腦缺血再灌注損傷的發生發展。NLRP3炎性小體的激活是一個多因素參與的過程，目前對于其機制的研究尚不明確，本文對NLRP3炎性小體與腦缺血再灌注關系的研究現狀和進展進行介紹。

1 Nod樣受體蛋白3炎性小體

炎性小體是胞內蛋白復合物，典型組成包括Nod樣受體（nod-like receptor，NLR）、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）和半胱天冬酶-1（pro-caspase-1）前體[1]。

NLR是一類胞內模式識別受體（pattern- recognition receptors，PRRs），由N端結構域、C端結構域和中央的核苷酸結合寡聚化結構域組成。其中N端結構域已知有4種：嘌呤結構域（pyrin domain，PYD）、caspase募集結構域（caspase recruitment domain，CARD）、桿狀病毒IAP重復序列（baculoviral IAP repeat，BIR）結構域和酸性反式激活結構域。ASC由PYD和CARD兩部分組成，這兩部分作為雙重接頭蛋白分子，以橋梁的形式將NLRP3及半胱天冬酶原-1連接起來形成炎性小體。每個NLRP3炎性小體有兩個半胱天冬酶原-1，ASC通過調節兩個單體的空間構象，使之成為有活性的半胱天冬酶-1（p20）和無活性的半胱天冬酶原（p10）兩個亞基。p20能夠剪切白介素前體（pro-IL）-1β和pro-IL-18，引起細胞凋亡[1]。

2 Nod樣受體蛋白3炎性小體的活化機制

NLRP3可識別多種激活物，外源性的激活物常見多種細菌，內源性的有尿酸鹽結晶、ATP、脂質體、活性氧（reactive oxygen spieces，ROS）、補體、淀粉樣小體和錯誤折疊的蛋白等[2]。

NLRP3炎性小體在體內處于自身抑制狀態，但是易于被激活。腦缺血再灌注時會發生自由基損傷、鈣超載、微循環障礙及白細胞（主要是中性粒）損傷作用，這些損傷都能夠被NLRP3識別。NLRP3炎性小體的激活機制還未完全明確，目前認為有以下幾種。

2.1 活性氧及線粒體功能紊亂介導活化機制 ROS可引起氧化應激導致細胞凋亡，在腦缺血再灌注時大量產生ROS。其來源一般有兩種：線粒體和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）。線粒體的活性氧（mitochondrial ROS，mROS）作為線粒體的產物能激活NLRP3炎性小體，也是形成成熟IL-1β所需的第二信號[3]。有研究表明，用mROS清除劑二苯基氯化碘（diphenyliodonium chloride，DPI）處理小鼠的巨噬細胞后，脂多糖誘導的NLRP3及IL-1β、IL-18表達量降低，但這一現象只在NLRP3炎性小體啟動的這一過程能夠觀察到[4]。細胞質中NADPH氧化酶產生的ROS最初被認為是NLRP3炎性小體活化所需信號，并且有化學抑制劑的實驗支持這一理論[5]。有研究顯示，人外周血單核細胞和鼠的巨噬細胞缺乏有活性的NADPH氧化酶，但是仍能觀察到有NLRP3炎性小體的活化[6]。

用化學抑制劑擾亂線粒體功能，可觀察到NLRP3炎性小體的激活[7]。然而，化學抑制劑會產生副產物，尤其在高濃度的時候，所以該機制尚有爭議。另外，氧化的線粒體的DNA釋放到細胞質中，能與NLRP3相互作用，并引起NLRP3下游的活化[8]。

2.2 低氧介導激活 腦缺血再灌注損傷伴隨著低氧，造成線粒體結構和功能受損，神經遞質失調及酸堿平衡紊亂。有研究證實，小鼠在腦低氧環境下能夠增加NLRP3的基因及其蛋白的表達，并通過限制pro-IL-1β的自噬使其水平升高。腦缺氧早期，海馬和丘腦的星形膠質細胞中就能觀察到NLRP3，之后發現星形膠質細胞和小膠質細胞均有表達[9]。另有研究表明，人前列腺上皮細胞在低氧環境下有NLRP3、黑色素瘤缺乏因子-2（absent in melanoma 2，AIM-2）和pro-IL-1β的表達升高。

2.3 鉀外流介導激活 在經典通路及非經典通路中鉀離子外流都是NLRP3炎性小體活化的必需條件[10]。大部分NLRP3的激活物，如ATP、尼日利亞菌素和顆粒物質都能夠造成鉀離子外流，從而引起NLRP3炎性小體活化。在非細胞系統中，低濃度的鉀離子也能夠引發NLRP3炎性小體聚集[11]。鉀離子的外流加速了NLRP3炎性小體的活化。在鉀離子無法外流的情況下，NLRP3炎性小體在巨噬細胞中發生活化突變體，且不被細胞外高鉀離子濃度所影響[12]。這提示了細胞內鉀離子濃度的降低可能誘發NLRP3炎性小體構象的改變。

2.4 溶酶體破裂 微粒物質通過細胞內吞作用、損傷溶酶體膜，導致組織蛋白酶B釋放到細胞質中，從而激活NLRP3炎性小體[13]。釋放到細胞質中的組織蛋白酶B、顆粒物質也引起K離子外流，進一步激活NLRP3炎性小體[14]。用組織蛋白酶B抑制劑CA-074-Me處理巨噬細胞能導致NLRP3活化被抑制。但組織蛋白酶B缺陷的巨噬細胞中NLRP3無法被微粒物質激活，而IL-1β并沒有減少，因此推測溶酶體破裂釋放組織蛋白酶B在激活NLRP3炎性小體中僅起到部分作用[15]。

2.5 其他機制 NLRP3炎性小體的活化多需要鈣離子的參與，一方面是因為鈣離子動員可引起鉀離子外流，另一方面是因為腦缺血再灌注時，鈣超載促進線粒體損傷，釋放更多ROS，進一步活化NLRP3炎性小體。但是鈣離子對AIM2和NLR家族CARD域蛋白4（NODlike receptor family CARD-containing 4 protein，NLRC4）炎性小體的活化沒有作用[16]。鈣離子螯合劑可抑制IL-1β的分泌[17]。內質網作為細胞內鈣池在此過程中起重要作用，使用藥物抑制劑或是shRNA敲除內質網上的鈣離子釋放通道，可減弱鈣離子動員及NLRP3炎性小體活化[18]。

3 腦缺血情況下可影響NLRP3炎性小體的藥物

3.1 夾竹桃麻素 NADPH和夾竹桃麻素都能顯著減少腦缺血再灌注損傷引起的NADPH氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）2、NOX4和ROS的增加，顯著抑制核因子κB抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor-κBα，IκBα）磷酸化和降解，NF-κBp65的核定位，還有NF-κB靶基因環氧化酶（cyclooxygenase，COX）2的表達和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，iNOS）的表達。在大鼠腦梗死模型中，NADPH和夾竹桃麻素都能抑制缺血的大腦皮層NLRP3、ASC、半胱天冬酶-1、IL-1β和IL-18的表達，并能減少腦梗死體積，提高梗死后的存活率及神經功能的恢復[19]。

3.2 鳶尾素 鳶尾素是骨骼肌來源的激素，可在不同物種的各種組織中合成，有抗腦缺血性損傷及腦保護作用。研究表明，神經元氧糖剝奪后，鳶尾素及其前體蛋白Ⅲ型纖維蛋白結構域5表達明顯減少，而氧化應激和ROS-NLRP3信號被激活；用鳶尾素或NLRP3抑制劑能夠抑制氧糖剝奪引起的氧化應激和炎癥，且鳶尾素的調節作用可被NLRP3過表達抑制。因此，鳶尾素可能通過抑制ROS-NLRP3信號通路減輕氧糖剝奪引起的神經元損傷[20]。

3.3 核因子E2相關因子2相關藥物 有研究表明核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor-2，Nrf2）在腦缺血再灌注損傷中能通過硫氧還蛋白（thioredoxin-1，Trx1）/硫氧還蛋白結合蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）抑制NLRP3炎性小體的形成的，從而起到腦保護作用。TXNIP從Trx1/TXNIP復合體分離下來，與NLRP3活化密切相關。在肝損傷和嚴重的狼瘡性腎炎患者中證實，Nrf2能促進抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）基因激活，抑制NLRP3炎性小體活化。小鼠大腦中動脈閉塞模型中，叔丁基對苯二酚治療上調Nrf2之后，TXNIP、NLRP3及caspase-1、IL-18、IL-1β的表達均明顯減少，而敲除Nrf2和Trx1則相反，在敲除Trx1時還抑制了Nrf2的保護作用。該研究認為，在腦缺血再灌注損傷時Nrf2通過對Trx1/TXNIP復合體的調節抑制NLRP3炎性小體的活化[21]。

在氧糖剝離再灌注模型建立之前用叔丁基對苯二酚或Nrf2 CRISPR質粒對BV2細胞做預處理，Nrf2活化可抑制NLRP3炎性小體的表達及下游IL-1β的形成。并且，NLRP3炎性小體的活化對ROS水平很敏感，Nrf2能夠降低ROS的產生。另外，作為一個Nrf2靶向ARE的基因，NADPH醌氧化還原酶參與了NLRP3炎性小體的抑制[22]。這給腦缺血再灌注損傷提供了一個新的治療靶點。

3.4 白藜蘆醇 白藜蘆醇是一種特異的去乙酰化酶沉默接合型信息調節因子2同源蛋白1（silent mating-type information regulator2 homolog 1，Sirt1）激動劑，有研究表明它通過抑制NLRP3炎性小體活化后Sirt1依賴的自噬活動來改善腦缺血再灌注損傷。在大鼠大腦中動脈閉塞模型中，病變側大腦半球NLRP3、半胱天冬酶-1、IL-1β和IL-18表達上升，并上調自噬活動。白藜蘆醇可減輕缺血再灌注損傷中NLRP3炎性小體引起的炎癥反應，下調自噬，減小腦梗死體積、減輕腦水腫，提高大鼠的神經功能評分。該抑制作用能夠被腦室內的注射白藜蘆醇抑制劑3-MA阻斷。轉染Sirt1小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）能阻斷白藜蘆醇對自噬活動的抑制，并抑制NLRP3炎性小體的活化[23]。

3.5 蘿卜硫素 蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）對腦缺血再灌注損傷有保護作用，但其機制尚不清楚。用SFN處理大腦中動脈閉塞大鼠，可抑制炎性小體活化及半胱天冬酶-1，IL-1β和IL-18的表達，減少腦梗死體積，提高神經功能評分，減少中性粒細胞浸潤[24]。

3.6 其他 有研究提示，間歇性禁食、靜脈注射免疫球蛋白、米諾環素、大黃酚、酪氨酸激酶等均能在腦缺血再灌注中抑制NLRP3炎性小體的活化[25-29]。傘形花內酯可通過上調過氧化物酶體增殖劑激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）γ的表達抑制TXNIP/NLRP3炎性小體[30]。

綜上所述，NLRP3在腦缺血再灌注損傷中是通過形成炎性小體，介導IL-1β等的產生，在固有免疫中起重要作用。很多針對NLRP3炎性小體的藥物也在動物實驗中取得良好的效果。但是由于鼠NLR家族成員與人NLR家族成員不完全相同，NLRP3炎性小體在人體中確切活化機制仍不明確，人體中NLRP3對炎癥損傷的介導機制及治療靶點仍需進一步研究。

【點睛】Nod樣受體蛋白3炎性小體能夠識別腦缺血再灌注的損傷信號并誘發炎癥趨化，最終引起腦組織損傷。