長鏈非編碼PCA3靶向miR-194影響前列腺癌細胞增殖和凋亡行為①

韓興濤 楊凌博 魏澎濤 李小輝 孫建濤 楊錦建

(洛陽市中心醫院泌尿外科，洛陽 471000)

前列腺癌是泌尿外科最常見的惡性腫瘤之一，尤其是在發達國家，前列腺癌的發病率一直居高不下[1]。雖然亞洲地區的前列腺癌發生率稍低于西方發達國家，但是近年來有不斷增長的趨勢[2]。廣泛的前列腺特異性抗原篩選技術的進步使前列腺癌的早期診斷率有所增加[3]。但是目前仍沒有公認的標準診斷方法，研究前列腺癌發展的分子和細胞機制是目前的主要研究熱點。

前列腺癌基因3(Prostate cancer antigen 3，PCA3)是在前列腺癌組織發現的一種表達水平異常的分子標志物[4]。PCA3是一種具有自我更新能力的基因，在多種人類腫瘤中呈現過表達狀態，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等[5-8]。PCA3還是一種具有促癌作用的功能性lncRNAs，有研究指出PCA3的表達異常可以導致細胞生長速度減緩，影響腫瘤細胞的發展進程[9]。

微小RNA(miRNA)是一種單鏈非編碼的調節RNA，可以通過堿基配對起到抑制蛋白質表達的作用，從而影響mRNA翻譯或降解過程[10]。異常表達miRNA在各種人類惡性實體腫瘤中都存在，包括前列腺癌[11]。有研究發現由miR-194介導的BMI蛋白表達的機制與前列腺癌的侵襲直接相關[12]。因此探討相關miRNA在前列腺癌中的表達及機制有助于推動前列腺癌的診斷和治療的進展。

本研究擬探討PCA3和miR-194對下游通路蛋白的影響作用，通過對前列腺癌細胞生物學行為的驗證及下游通路的激活情況，明確PCA3和miR-194在前列腺癌中的可能作用機制，以期為前列腺癌的診治提供一個潛在的新靶標。

1 材料與方法

1.1材料 前列腺癌細胞株PC-3M-2B4、PC3、Du145和LNCaP均購自上海細胞研究所，用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液在37℃、 5%CO2的培養箱中培養和傳代。Ras、MEK1、MEK2抗體購自美國Abcam公司(ab52939、ab32091、ab32517)。脂質體Lipofectamine 2000、PCA3+siRNA和miR-194-mimic購自重慶艾生生物科技公司。Trizol購自北京天辰生物科技公司。反轉錄試劑盒(FSQ-101)購自日本TOYOBO公司(FSQ-101)。PCR試劑盒購自成都榮海生物公司。熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京Promega公司。熒光素酶報告載體購自上海吉爾生物公司。

1.2方法

1.2.1qPCR試驗 使用Trizol試劑提取前列腺癌細胞的總RNA，并使用TM miRNA分離試劑盒(Ambion，Austin，TX，USA)進一步純化miRNA部分。通過光譜測定RNA樣品的濃度和純度。PCA3的引物序列：5′-CATTTATATTGCTGGCCCTTCTGC-TTTC-3′(正向)和5′-GAAAGCAGAAGGGCCATAAAAGTAATG-3′(反向)。 miR-194的引物序列：5′-GAGTTTGATCATGGCTCAGAGAGTTTGATCCTG-3′(正向)和5′-CGACGGCCAGTCTTACCAGGAAACAGCTATG3′(反向)。使用實時PCR系統進行實時反轉錄PCR(qPCR)。使用U6管家基因作為對照。使用2-ΔΔCt方法計算肺癌細胞的miRNA相對表達量。實驗重復3次。

1.2.2雙熒光素酶活性測定 為了檢測PCA3和miR-194的相關關系，我們使用雙熒光素酶實驗進行測定，將24孔板中的LNCaP細胞與0.4 mg熒光素酶報告載體和0.1 mg含有海腎螢光素酶(Promega)的pRL-TK對照載體共轉染，根據 siPORTneoFX使用方法操作，在轉染后48 h制備裂解物。使用雙熒光素酶報告基因測定系統(Promega)，測定轉染24 h后熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.2.3克隆形成實驗檢測前列腺癌細胞的增殖能力 常規培養的前列腺癌LNCaP細胞經胰酶消化后，1 000 r/min離心3 min，離心半徑12 cm，棄去上清液。加入5 ml的無菌PBS溶液，輕輕吹散洗滌細胞沉淀并再次離心。反復洗滌3次后加入培養液，制備成單細胞懸液。測定前列腺癌LNCaP細胞濃度并調整為1 000 cells/ml，將單細胞懸液均勻種植在無菌6孔板內，進行克隆形成培養。分為PCA3+siRNA實驗組和NC對照組。每3 d更換一次培養基，14 d后觀察腫瘤細胞克隆形成情況。實驗重復3次。

1.2.4細胞凋亡實驗 實驗前約24 h，接種兩瓶LNCaP細胞，標記①、②，每瓶含約6 ml培養液，置37℃、5%CO2培養箱培養。 實驗前約2.5 h，當細胞密度達到70%時，①號瓶加入三尖杉酯堿200 μl，使終濃度為1 μg/ml;②號瓶中加入同等量的PBS(pH7.4)作對照。共同放入培養箱中繼續培養2.5 h。染色：將瓶中的細胞搖勻取200 μl于1.5 ml的離心管中，加入配置液2 μl，PI 染液20 μl，染色15 min。滴片：取載玻片用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以上染色后的細胞懸液10 μl，加入小室內蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發光，高倍鏡下觀察，區別三種細胞，并注意三者比例。

1.2.5Western blot蛋白印跡分析 用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞總蛋白，并將其轉移到硝酸纖維素膜(Bio-Rad，Hercules，CA)上。使用5%脫脂牛奶充分封閉膜，并與一抗(Ras、MEK1、MEK2濃度1∶1 000)，內參GAPDH(濃度1∶2 000)，4℃，孵育過夜。次日，TBST充分沖洗過后，使用二抗辣根酶標記物(濃度1∶2 000)孵育2 h，TBST充分沖洗過后，使用碧云天化學發光試劑ECL顯影液檢測目標蛋白的表達水平。使用GAPDH作蛋白內參對照。實驗重復3次。

1.3統計學方法 所有實驗數據統計使用SPSS統計軟件進行分析。組間數據分析使用t檢驗。P<0.05時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1前列腺癌細胞株中PCA3和miR-194的表達水平 qPCR結果表明：與其他細胞株相比，LNCaP細胞中PCA3 mRNA表達水平明顯較高[(1.52±0.23) vs (0.29±0.08)，P=0.004]，差異有統計學意義，見圖1A；miR-194在LNCaP細胞株中表達水平比其他前列腺癌細胞低(P=0.016)，見圖1B。所以我們挑選LNCaP作為進一步生物學功能實驗的細胞株。

2.2雙熒光素酶檢測PCA3和miR-194之間的關系 為明確與PCA3相關的miRNA的情況，我們使用生物信息學預測工具發現PCA3可能與miR-194有直接作用，兩者有相似的結合序列，見圖2A。為了驗證PCA3能否與miR-194 3′UTR結合，我們將PCA3-siRNA與miR-194共轉染到前列腺癌LNCaP細胞中。雙熒光素酶報告基因結果顯示：PCA3-siRNA可以明顯抑制miR-194的熒光素酶活性(P=0.025)，見圖2B。結果表明，PCA3-siRNA能與miR-194的3′UTR特異性結合。

圖1 PCA3和miR-194在前列腺癌細胞株中的表達Fig.1 PCA3 and miR-194 expression in prostate cancer cell lines

圖2 雙熒光素酶檢測PCA3和miR-194之間的關系Fig.2 Dual luciferase assay for the relationship between PCA3 and miR-194Note:A.Binding sites for PCA3 and miR-194;B.Double luciferase to detect the relationship between PCA3 and miR-194.*.P<0.05.

2.3PCA3對前列腺癌細胞增殖和凋亡的影響 克隆形成結果顯示(圖3A、B)：PCA3+siRNA組的細胞數目明顯少于NC對照組的細胞數目[(170.25±5.61)vs(58.36±3.95)，P=0.019]，差異有統計學意義。凋亡試驗結果表明，PCA3+siRNA組細胞凋亡數目明顯多于NC對照組的細胞凋亡數目，表明PCA3可以抑制腫瘤細胞的凋亡行為，見圖3C。綜上結果表明，抑制PCA3的表達可以減弱前列腺癌LNCaP細胞的增殖能力，且可在一定程度上加速其凋亡進程。

2.4miR-194和PCA3對前列腺癌細胞增殖作用的逆轉影響 為了檢測miR-194和PCA3對前列腺癌LNcaP細胞增殖和凋亡能力的影響，克隆形成結果顯示(圖3A)：PCA3-siRNA+miR-194-mimic組的細胞數目明顯多于PCA3+siRNA的細胞數目[(195.59±11.42)vs(78.34±5.64)，P=0.008]，差異有統計學意義，見圖4A、B。凋亡試驗結果(圖4C)，表明PCA3+siRNA+miR-194-mimic組細胞凋亡數目與PCA3+siRNA組的細胞凋亡數目相近，說明miR-194可以在一定程度上逆轉腫瘤細胞的凋亡行為。綜上結果表明，miR-194可以逆轉PCA3對前列腺癌LNCaP細胞增殖能力的影響，且可在一定程度上逆轉LNCaP細胞的凋亡行為。

圖3 PCA3對前列腺癌細胞增殖和凋亡的影響Fig.3 Effect of PCA3 on proliferation and apoptosis of prostate cancer cellsNote:A.Effect of PCA3 on proliferation of prostate cancer cells;B.PCA3 on apoptosis of prostate cancer cells;C.Apoptosis assay was used to detect the effects of PCA3 on the apoptosis of prostate cancer cells.*.P<0.05.

圖4 miR194對PCA3逆轉前列腺癌細胞增殖的影響Fig.4 Effect of miR-194 on the reversal effect of PCA3 on proliferation of prostate cancer cellsNote:A.miR-194 reverses the proliferation of prostate cancer LNcaP cells;B.miR-194 on apoptosis of LNCaP cells in prostate cancer;C.Apoptosis assay was used to detect the effects of PCA3 and miR-194 on the apoptosis of prostate cancer cells.*.P<0.05.

圖5 PCA3對ERK信號通路的激活情況Fig.5 Activation of ERK signaling pathway by PCA3Note:A.Effect of PCA3 on protein expression in ERK signaling pathway;B.The corresponding expression level of the ERK signaling pathway protein.*.P<0.05.

圖6 miR-194對ERK信號通路的影響Fig.6 Effect of miR-194 on ERK signaling pathwayNote:A.Effect of miR-194 on the reversal of protein levels in ERK signaling pathway;B.Effects of miR-194 on the expression of ERK signaling protein.*.P<0.05.

圖7 抑制PCA3后前列腺癌LNCaP細胞成瘤能力減弱Fig.7 Prostate cancer LNCaP cells have reduced tumorigenic ability after inhibition of PCA3Note:A.Ability in the vivo tumorigenicity of LNCaP cells were enhanced in nude mice after silencing PCA3;B，C.Comparison of tumor volume and quality in nude mice.*.P<0.05.

2.5PCA3對ERK信號通路的激活情況 在PCA3+siRNA實驗組中MEK1和MEK2的表達情況比NC組的明顯降低[MEK1(0.85±0.16)% vs(0.25±0.05)%，P=0.016；MEK2(0.89±0.09)% vs(0.36±0.10)%，P=0.019]，而Ras的表達水平升高[Ras(0.51±0.06)% vs(0.98±0.12)%，P=0.021]，見圖5A、B。結果表明，抑制PCA3后，ERK信號通路相關蛋白的激活水平受到一定的影響，表明PCA3的表達和ERK信號通路的激活有相關關系。

2.6miR-194對ERK信號通路的影響 在PCA3+siRNA+miR-194-mimic組中MEK1和MEK2的表達情況相比PCA3+siRNA組升高[MEK1(0.52±0.06)% vs(0.21±0.05)%，P=0.033；MEK2(0.75±0.11)% vs(0.31±0.08)%，P=0.031]，而Ras的表達水平升高[Ras(0.60±0.06)% vs(1.23±0.22)%，P=0.013]，見圖6A、B。結果表明，過表達miR-194后，ERK信號通路相關蛋白水平得到一定的恢復，表明miR-194在一定程度上可以逆轉PCA3對ERK信號通路的抑制作用，間接說明PCA3可能是通過miR-194對下游ERK信號通路進行調控的。

2.7抑制PCA3后，前列腺癌LNCaP細胞成瘤能力減弱 裸鼠體內成瘤實驗表明，與對照組相比，抑制PCA3后的前列腺癌LNCaP細胞在裸鼠體內成瘤能力明顯減弱，4周后腫瘤體積較對照組大[(1.35±0.15)cm3vs(0.39±0.16)cm3，P<0.05]，4周后腫瘤質量較對照組重[(1.34±0.09)g vs (0.42±0.12)g，P<0.05],差異有統計學意義。見圖7。說明抑制PCA3后前列腺癌LNCaP細胞的裸鼠體內成瘤能力相應減弱。表明PCA3對前列腺癌細胞的成瘤能力有一定的增強作用，可能在前列腺癌的發展過程中起到一定的促癌作用。

3 討論

前列腺癌是最常見的泌尿系統惡性腫瘤之一，尤其在西方發達國家[13]。目前前列腺癌的早期檢測主要依賴于直腸指檢和前列腺特異性抗原(PSA)的篩查，但是，由于其陽性預測值較低，只有10%～35%的患者可以早期篩查出來，而且前列腺活檢的可實施性不高[14]。針對前列腺癌的分子基因方面的研究是目前的研究熱點，尤其是新的前列腺癌基因篩查。

美國學者報道，PCA3針對前列腺癌的診斷準確性較高，在多數前列腺癌患者中都存在異常表達，和PSA聯合篩查可以提高前列腺癌72%的診斷特異性和58%的敏感度[15]。也有學者指出，PCA3和前列腺癌的臨床病理參數有一定的關聯[16]。以前的研究已經將PCA3列為前列腺癌的高效診斷指標，然而其在前列腺癌中的作用方式及機制說法不一。我們通過生物信息學預測PCA3和相關miRNA在前列腺癌中的表達關系，然后進一步驗證其可能的作用機制，為揭示PCA3在前列腺癌中的具體作用方式提供支持。

miRNA是一類內源性的、高度保守的非編碼單鏈RNA，廣泛存在于植物和多細胞動物的基因組中[17]。miR-194的編碼基因位于染色體12p36上，研究表明，miR-194受多種抑癌基因的直接調控，從而影響下游靶基因發揮生物學功能。何涵等[18]使用miR-194-mimic轉染肝細胞癌細胞，發現肝癌細胞的增殖能力明顯減弱。miR-194已被證實在多種腫瘤的生長過程中扮演重要作用。例如，在最近的一項研究中發現，miR-194是通過減少肝細胞EMT來影響肝癌細胞的轉移[19]。

本研究試圖通過研究PCA3和miR-194之間的相互關系，推斷出PCA3和miR-194在前列腺癌中的作用方式。首先通過雙熒光素酶實驗證實PCA3可以調控miR-194的表達及活性，然后通過MTT增殖實驗和細胞凋亡實驗檢測PCA3對前列腺癌細胞增殖能力和凋亡行為的促進作用，之后轉染miR-194-inhibitor后發現前列腺癌細胞被抑制的增殖能力和凋亡行為得到一定程度的逆轉，表明PCA3是通過調控miR-194表達活性影響前列腺癌細胞的生物學行為。同時Western blot實驗檢測到ERK信號通路的關鍵蛋白表達水平也受PCA3和miR-194的調控。ERK信號通路受到多種miRNA調控，介導不同腫瘤細胞的生長和凋亡行為[20]。針對ERK通路蛋白在細胞中的表達水平不同，有研究提出其可能和細胞表面受體數量和活性相關，當其表達上調或激活時，可以影響細胞本身的增殖行為[21]。

本研究通過以上實驗提示PCA3和miR-194可能通過ERK信號通路參與前列腺癌細胞增殖過程和凋亡行為，為前列腺癌的早期診斷和治療方式的改變提供一定的理論支持，為前列腺癌的治療效果和預后監測提供幫助。