枯草芽孢桿菌 ATCC9372產生海藻酸寡糖通過T輔助細胞2型相關細胞因子能有效抑制哮喘發作的研究

沙尚清 尹 梅 韓學梅 楊春霞 舒 紅

(寧夏醫科大學銀川醫院呼吸內科，銀川 750000)

哮喘又名支氣管哮喘是一種普遍的嚴重危害人類健康的疾病，發病率逐年增高，治療十分棘手[1]。根據世界衛生組織2015年發布的哮喘資料顯示，全世界大約有2.55億人患有哮喘。 2013年一份報告顯示，僅中國就大約有2 000萬哮喘患者，其中16歲以下的未成年人和60歲以上的老人發病率更高[2]。較10年前的調查結果分別增高了117.8%和160.9%[3]。哮喘誘發劑有許多，如室內和室外過敏原、病毒感染和污染。寵物皮屑和蟑螂是室內過敏原，花粉、霉菌和真菌是室外過敏原。煙草煙霧、化學刺激物和空氣污染是污染物[4，5]。 哮喘的典型臨床癥狀包括咳痰、杯狀細胞增生、上皮細胞脫落、基底膜增厚、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤。 這些癥狀最終導致氣道阻塞。哮喘發病機制較為復雜，有研究表明氣道慢性炎癥是哮喘的本質，其中Th1/Th2表達失衡，即Th1功能不足與Th2功能亢進是氣道慢性炎癥發生的基礎[6]。臨床研究報道，在哮喘患者中Th1/Th2失衡直接源于其上游轉錄因子T細胞T盒蛋白(T-box expressed in T cells，T-bet)/GATA結合蛋白(GATA-binding protein，GATA)-3平衡失調，動物實驗研究結果表明，Th1特異性轉錄因子T-bet基因缺失可導致小鼠自發出現哮喘樣氣道炎癥的表現[1，7，8]。 T-bet是控制Th1增殖的重要轉錄因子，通過IFN-γ和 IL-12相互作用可以增加Th1的表達，GATA-3是控制Th-2增殖的轉錄因子[9]。支氣管擴張劑，如皮質類固醇、白三烯調節劑、茶堿等藥物目前用于哮喘的治療，但是療效甚微。大劑量皮質類固醇的吸入是控制哮喘發作的常用方法[10-13]。 然而，這種治療方法有很大的副作用，往往會降低糖皮質激素受體結合親和力以及T細胞反應[14]。 因此，越來越多的研究致力于從天然產物和傳統藥物中尋找治療哮喘的藥物。海藻酸鈉是海藻莖上的一種黏性物質[15]。已被用作抗慢性潰瘍性結腸炎的抗炎劑以及抗氧化劑。 也被用于封裝材料和微針結構。已有研究表明海藻酸寡糖(Alginate oligosaccharides，AO)可以克服耐藥性，增強抗生素的作用，并能用于高鹽飲食誘導的大鼠高血壓模型的治療[16]。 盡管很多研究證實了AO的抗炎和抗氧化特性，但其在治療哮喘中的作用尚不清楚。 因此，本研究主要研究了由枯草芽孢桿菌ATCC9372產生的AO對卵清蛋白(OVA)誘導的小鼠哮喘模型的治療作用[6]。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組 32只健康8周齡的SPF級小鼠雌雄各半，體重20 g，購自揚州大學實驗動物中心。12 h晝夜交替，給予充足的水和食物飼養。按照實驗要求隨機分為4組，每組8只(n=8)，分別為正常對照組、OVA誘導哮喘模型組、海藻酸寡糖(AO)低劑量治療組：50 mg/kg和海藻酸寡糖(AO)高劑量治療組：200 mg/kg。

1.1.2藥物 雞卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)購自上海朗頓生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌購自北京金四環科技有限責任公司。

1.1.3試劑及儀器 光學顯微鏡購自上海光學儀器廠；-20℃低溫冰箱購自北京福意電器有限公司；低溫高速離心機購自H2050R-1湖南湘儀離心機有限公司；CO2細胞培養箱和流式細胞儀購自Thermo Fisher Scientific公司；Amicon過濾器購自Sigma公司；PE標記的家兔抗小鼠干擾素(Interferon，IFN)-γ購自上海生物工程有限公司；IL-4購自南京建成生物工程研究所；小鼠β-肌動蛋白(Actin)檢測引物由上海生工生物工程有限公司合成；山羊抗小鼠CD3、CD8、CD68和CD4均購自武漢谷歌生物科技有限公司； NaCl、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2和水合氯醛購自上海試一化學試劑有限公司；蛋白胨、酵母提取物和海藻酸購自偃師市百家工貿有限公司；甘露糖醛酸寡糖DP5購自法國ELICITYL SA公司。

1.2方法

1.2.1模型制作及給藥方法 ①OVA誘導哮喘模型組：第1～8天小鼠腹腔注射40 mg/L OVA抗原溶液0.5 ml、1 mg氫氧化鋁水合物進行致敏反應；然后于第21～25天連續5 d用10%水合氯醛按照3 ml/kg 腹腔注射麻醉小鼠后，使用噴霧器將5%OVA溶液噴鼻30 min激發；②正常對照組：采用無菌生理鹽水代替OVA溶液；③海藻酸寡糖(AO)50 mg/kg組：采用上述方法建立哮喘模型，在誘導哮喘的第25～29天，將海藻酸寡糖(AO)按照50 mg/kg劑量每天進行一次灌胃，時間間隔24 h；④海藻酸寡糖(AO)200 mg/kg組：方法同海藻酸寡糖(AO)50 mg/kg 組，第25～29天將海藻酸寡糖(AO)以200 mg/kg 劑量每天進行一次灌胃，時間間隔 24 h。4組小鼠最后一次灌胃治療24 h后處死小鼠。

1.2.2AO生產和鑒定 從海帶褐藻中提取海藻酸鈉，制得AO：首先，將枯草芽孢桿菌 ATCC9372在含有0.1%海藻酸鈉、1%蛋白胨、1%酵母提取物、0.2%NaCl、0.2%K2HPO4、0.1%KH2PO4和0.1%MgSO4的150 ml混合培養基中進行培養，37℃，150 r/min，培養3 d。 然后將含有芽孢桿菌的混合培養液加入到海藻酸鹽培養基中(3%海藻酸鈉、1%蛋白胨、1%酵母提取物、0.2%NaCl、0.2%K2HPO4、0.1%KH2PO4、0.1%MgSO4、0.05%CaCl2和0.1%微量元素調節pH7.0)，37℃溫育14 d后，通過離心(10 000 r/min，30 min)獲得培養上清液。 使用Amicon過濾器(Millipore，Billerica，MA，USA)分離低于分子量10 kD的AO，最后冷凍干燥，-80℃儲存備用。將分子量低于10 kD的AO分離后，通過HPLC-蘇州島津LC-15C液相色譜儀分析和鑒定。

1.2.3觀察項目及檢測方法

1.2.3.1血清總IgE及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎性細胞和嗜酸性粒細胞數目測定 末次激發24 h后處死小鼠，立即摘眼球取血，4℃、4 000 r/min離心15 min獲取血清。用1 ml(分別為0.4、0.3、0.3 ml)PBS液行支氣管肺泡灌洗，回收率均>85%。BALF 4℃、1 500 r/min離心10 min，收集上清。用ELISA法檢測血清中IgE;Kwik-Diff染色法計數BALF中炎性細胞和嗜酸性粒細胞的數量。

1.2.3.2免疫組織化學測量CD3+、CD4+、CD8+和CD68+的表達變化及其特征性分泌形式的表達 用3%過氧化氫的甲醇溶液處理石蠟的組織切片10 min以除去內源性過氧化物酶。使用檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mol/L)進行抗原修復。 將載玻片與正常血清一起孵育以阻斷非特異性結合，然后使用一抗(稀釋1∶100～1∶200)例如兔抗小鼠CD3多克隆抗體、大鼠抗小鼠CD4單克隆抗體、大鼠抗小鼠CD8單克隆抗體和大鼠抗小鼠CD68單克隆抗體；大鼠抗小鼠IL-4單克隆抗體、大鼠抗小鼠IL-5單克隆抗體、兔抗小鼠IL-6單克隆抗體、山羊抗小鼠TNF-α多克隆抗體、山羊抗小鼠IL-13多克隆抗體和兔抗小鼠IFN-γ-單克隆抗體。 再滴加二抗(1∶500)共孵育1 h。DAB顯色，DAB的配制①儲備液(DAB 25 mg/ml)的配制：DAB 250 mg+PBS 10 ml，待完全溶解后分裝成1 ml、100 μl、50 μl、20 μl等，-20℃，凍存。②工作液：DAB 儲備液20 μl+PBS 1 000 μl+3% H2O25 μl。

1.2.3.3RT-PCR 測量Th2和Th1相關細胞因子的mRNA的表達水平 小鼠肺組織總RNA提取與定量，參照試劑商所提供的產品說明書進行。PCR擴增：小鼠IL-1β引物可擴增長度為374 bp(F：5′-CTCAGAAGCAGAGCACAAGC-3′，R：5′-CTCAGTG-CAGGCTATGA C CA-3′)；IFN-γ引物可擴增長度為556 bp(F：5′-AATGAACGCTACACACTGCA-3′，R：5′-TGAAGAAGGTAGTAATCAGG-3′)；IL-13引物可擴增長度為638 bp(F：5′-GCCAGGTGTCTTAGCC-AGTC-3′，R：5′-ATGGCCTGGAACTCTGTCTG-3′)；TNF-α引物可擴增長度為286 bp(F：5′-CCACATCTCCCTCCAGAAAA-3′，R：5′-AGGGTCTGGGCCATAGAACT-3′)；IL-4引物可擴增長度為509 bp(F：5′-AATGAACGCTACACACTGCA-3′，R：5′-GTFATGTGGACTTGGACTCA-3′)；IL-5引物可擴增長度為483 bp(F：5′-CCAGCTAGTTGTCATCCTGC-3′，R：5′-TGAAGAAGGTAGTAATCAGG-3′)；IL-6引物可擴增長度為3 586 bp(F：5′-CCAGCTAGTTGTCA-TCCTGC-3′，R：5′-GTFATGTGGACTTGGACTCA-3′)；β-actin引物可擴增片段長度為259 bp(F：5′-GAAATCGTGCGTGACATC-3′，R：5′-GCTTGCTGATCCACATCT-3′)。

2 結果

2.1小鼠BALF中炎性細胞和嗜酸性粒細胞數目 哮喘模型的炎性細胞( 圖1A )和嗜酸性粒細胞(圖1B)均顯著高于正常組和AO 50 mg/kg和AO 200 mg/kg組(P<0.05)。不同劑量的AO組間炎性細胞和嗜酸性粒細胞均有顯著性差異；AO以劑量依賴的方式顯著抑制OVA誘導哮喘模型的炎性細胞和嗜酸性粒細胞的表達。

2.2血清中IgE的表達水平 隨著AO劑量的增加顯著降低OVA誘導的血清中IgE的表達水平(圖2)。模型組血清中的IgE的表達顯著高于正常組和AO(50 mg/kg)組和AO(200 mg/kg)組。并且AO劑量越大，血清中IgE的表達越低。不同劑量的AO組間沒有顯著性降低。

圖1 小鼠BALF中炎性細胞和嗜酸性粒細胞Fig.1 Inflammatory cells and eosinophils in mouse BALFNote: *.Model group vs normal group (P<0.05);#.AO (50 mg/kg) vs model group;+.AO (200 mg/kg) vs model group (P<0.05);△.AO (50 mg/kg) vs AO (200 mg/kg) (P<0.05).

圖2 AO對OVA誘導哮喘模型的血清中IgE表達水平的影響Fig.2 Effect of AO on serum IgE expression in OVA-induced asthmatic modelNote: *.Model group vs normal group (P<0.05);#.AO (50 mg/kg) vs model group;△.AO (200 mg/kg) vs model group (P<0.05).

圖3 AO對Th2和Th1相關細胞因子表達的影響Fig.3 Effect of AO on Th2 and Th1 related cytokine expressionNote: *.Model group vs normal group (P<0.05);#.AO (50 mg/kg) vs model group;+.AO (200 mg/kg) vs model group (P<0.05);△.AO (50 mg/kg) vs AO (200 mg/kg) (P<0.05).

圖4 Th2和Th1相關細胞因子表達的mRNA的表達水平Fig.4 Expression levels of mRNAs expressed by Th2 and Th1 related cytokinesNote: *.Model group vs normal group (P<0.05);#.AO (50 mg/kg) vs model group;+.AO (200 mg/kg) vs model group (P<0.05);△.AO (50 mg/kg) vs AO (200mg/kg) (P<0.05).

2.3小鼠哮喘模型中Th2和Th1相關細胞因子的表達 為了檢查AO對T細胞調節的影響，通過免疫組織化學測量CD3+、CD4+、CD8+和CD68+的表達變化。AO抑制CD3+、CD4+、CD8+和CD68+的表達(圖3)。AO組顯著低于模型組(P<0.05)，不同劑量AO組間差異顯著；隨著AO劑量的增加，AO對CD3+、CD4+、CD8+和CD68+的抑制程度也顯著增加(P<0.05)。

2.4小鼠哮喘模型中Th2和Th1相關細胞因子的mRNA的表達水平 Th1相關因子(IL-1β和IFN-γ)和Th2相關因子(TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6和IL-13)的mRNA的表達( 圖4A )和結果統計分析(圖4B)，結果可知AO降低IL-1β和IFN-γ的mRNA水平。 AO處理后Th1和Th2相關細胞因子的mRNA水平呈劑量依賴性抑制，AO顯著抑制IL-5、IL-6和IL-13 mRNA水平的表達。

圖5 Th2和Th1相關細胞因子其分泌形式的表達Fig.5 Expression of secreted forms of Th2 and Th1 related cytokinesNote: *.Model group vs normal group (P<0.05);#.AO (50 mg/kg) vs model group;+.AO (200 mg/kg) vs model group (P<0.05);△.AO (50 mg/kg) vs AO (200 mg/kg) (P<0.05).

2.5小鼠哮喘模型中Th2和Th1相關細胞因子其分泌形式的表達 哮喘的特征是炎性細胞分泌增加，Th2和Th1衍生的促炎細胞因子失衡。通過評估Th1相關細胞因子(IFN-γ)和Th2相關細胞因子(IL-4、IL-5、IL-6和IL-13)分泌形式的表達(圖5)可知，在小鼠哮喘模型的肺組織中，Th1和Th2相關的細胞因子都過表達。 AO不僅抑制Th2相關的細胞因子，如IL-4、IL-5、IL-6和IL-13，還抑制Th1相關的細胞因子，如IFN-γ。

3 討論

哮喘發病機制十分復雜，目前越來越多的學者認為氣道的慢性炎癥是哮喘的本質，Th1/Th2平衡失調是氣道炎癥發生的基礎[6]。疾病的嚴重程度與浸潤的炎癥細胞及其細胞因子的表達有關。迄今為止，已知與CD4-T細胞和嗜酸性粒細胞有關的Th2細胞因子在哮喘的發展中起主要作用[17]。隨著分子免疫學與分子生物學的飛速發展，國內外對哮喘發病機制的研究越來越深入，現在免疫療法的概念有了較大的更新與拓展，即將有可能在基因水平上對哮喘開展免疫治療，免疫糾偏基因治療有望成為哮喘研究的一個新的方向[1]。

Th1相關的細胞因子(IL-12和IFN-γ)，Th2相關細胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)，炎性細胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達失衡都與哮喘發作有關[18]。 其中IL-1是許多炎癥性疾病的重要物質，IL-4和IL-13是哮喘的關鍵調節因子。 IL-4也可以介導免疫球蛋白(Ig)G轉變為IgE并募集嗜酸性粒細胞[19]。 IL-5調節嗜酸性粒細胞的發展、活化、遷移和存活，并刺激IL-6的表達。 IL-12調節Th1和Th2表達的平衡，它也產生IFN-γ[20]。 IL-13參與B細胞活化和氣道重塑，導致黏液分泌過多、杯狀細胞增生、上皮細胞脫落、基底膜增厚、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤[21]。TNF-α可刺激粒細胞募集和成纖維細胞增殖。本研究中哮喘模型組小鼠肺組織中Th2和Th1的促炎癥細胞尤其Th2細胞因子表現為異常增多，完全符合上述機制。我們證明AO可以減少小鼠肺泡清洗液中總炎性細胞和嗜酸性粒細胞的數量以及血清中IgE的表達水平。AO顯著抑制CD4和CD68的表達。哮喘相關細胞因子 L-13，IL-4和IL-5的mRNA表達水平幾乎完全被抑制。AO不僅下調Th1/2細胞增殖的轉錄因子(如T-bet和GATA-3)的表達水平，而且下調Th1/2細胞因子如IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13等。本研究中，AO以劑量依賴的方式降低IL-13的 mRNA表達水平，200 mg/(kg·d)的AO可以完全阻斷IL-5和IL-6 的mRNA表達。 此外，AO劑量依賴性地抑制IL-5和IL-13的表達。 幾項研究報道，哮喘患者肺泡清洗液中 IFN-γ水平升高，乙酰膽堿誘導的氣道高反應性在IFN-γ轉基因小鼠中比正常小鼠中更為嚴重[22]。本研究發現AO可降低OVA誘導的小鼠哮喘模型中IFN-γ水平和Th2相關細胞因子的表達。

盡管類固醇已被用作抗哮喘藥物，但由于其相關的副作用已迫使研究人員尋找更有效的候選藥物[23]。細胞因子可以誘導哮喘發作，積極調節這些細胞因子的化合物可能具有潛在的治療益處。但是哮喘模型的動物實驗結果能否在臨床取得相同的預期甚至更好的療效還有待于進一步的研究和探索。這項研究的結果表明，由于其抑制各種類型的細胞因子的能力，AO可能顯示出作為抗哮喘藥物候選物的希望。