五味子甲素通過抑制NLRP3炎癥小體活化減輕失血性休克大鼠的腎臟損傷①

甘永雄 俞 鳳

(安徽醫科大學第一附屬醫院，合肥 230022)

短時間大量失血引起的全身多器官功能衰竭是導致失血性休克患者死亡的主要原因[1]。其中，腎臟是最易受累的器官之一[2,3]。研究表明，炎癥反應和線粒體功能障礙參與了失血性休克誘導腎臟損傷的過程[4-6]。NLRP3炎癥小體激活是介導腎臟炎癥反應的主要因素[7]。抑制NLRP3炎癥小體的活化可減輕慢性腎病小鼠的腎纖維化和線粒體功能紊亂，還可促進失血性休克大鼠的腎功能的恢復[7,8]。因此，尋找新的藥物及方法抑制NLRP3炎癥小體的活化將有利于失血性休克后腎臟功能的修復。五味子甲素是從五味子中提取的一類木質素類成分，具有抗凋亡及免疫調節等作用，同時還具有較強的抗炎活性[9-11]。研究表明，五味子甲素可通過抑制NLRP3炎癥小體激活抑制IL-1β的分泌和線粒體ROS的釋放[12]。但五味子甲素是否能通過調控NLRP3炎癥小體的激活減輕失血性休克誘導的腎損傷還未見報道。因此，本文將通過復制失血性休克模型探究五味子甲素對失血性休克大鼠腎臟損傷的作用。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 五味子甲素購自上海純優生物科技有限公司。血肌酐(Serum creatinine,Scr)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase,SDH)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。Caspase-1一抗購自美國CST公司，HRP標記的IgG山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司。IL-1β、TNF-α和GAPDH引物由上海生工設計合成。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型的建立 實驗所用SD大鼠由浙江大學實驗動物中心提供，體重220～280 g。適應性喂養3 d后，將大鼠隨機分為對照組、模型組、五味子甲素20 mg/kg組、五味子甲素40 mg/kg組和五味子甲素80 mg/kg組，實驗前12 h禁食不禁水。根據文獻[13]報道方法復制大鼠失血性休克模型。除對照組外，其他組大鼠用水合氯醛麻醉后，分離左側股動脈和股靜脈并插入導管，股靜脈導管連接灌注泵以隨時補充液體，股動脈導管用于失血處理，放血量約為全身的60%左右。同時分離左側股動脈，用導管連接RM6240BD生物信號采集系統以連續監測平均動脈壓力，血壓控制在35～40 mmHg，維持1.5 h后進行復蘇。對照組大鼠除不做失血處理外，其他處理同上。完成模型復制后，五味子甲素20 mg/kg組、五味子甲素40 mg/kg組和五味子甲素80 mg/kg組大鼠即刻腹腔注射給予相應濃度的五味子甲素，對照組和模型組給予等量溶媒，24 h后取靜脈血及腎臟組織進行后續實驗。

1.2.2試劑配制 精密稱取8 g五味子甲素溶于10 ml生理鹽水中配制成0.8 g/ml的五味子甲素母液，用前稀釋，并用羧甲基纖維素鈉助溶，使其終濃度不超過0.5%。

1.2.3試劑盒檢測 給予五味子甲素24 h后，靜脈取血，并以3 500 r/min轉速4℃離心15 min，取上層血清根據試劑盒說明書檢測血清中Scr、BUN的含量。

1.2.4線粒體提取及檢測 用水合氯醛麻醉大鼠后，取腎臟并快速分離去除結締組織和脂肪組織，將分離后的組織放入預冷的線粒體分離緩沖液中，并剪碎至1 mm。隨后用含5%BSA的線粒體分離緩沖液進行勻漿，過濾除去組織殘渣后梯度離心提取線粒體，再用緩沖液重懸沉淀，并根據試劑盒說明書加入顯色劑，檢測吸光度，計算蛋白含量。最后用試劑盒檢測線粒體中SDH、SOD和GSH-Px的活性。

1.2.5qRT-PCR 用試劑盒提取組織總RNA。根據反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，用PCR儀進行擴增，凝膠電泳法對擴增產物進行定量分析。實驗所用到引物均由上海生工設計合成。其引物序列如下：IL-1β上游引物：5′-GCAACTGTTCCTGAA-CTCAACT-3′，下游引物：5′-ATCTTTTGGGGTCCGT-CAACT-3′；TNF-α上游引物：5′-TTCGGAACTCACTGGATCCC-3′，下游引物：5′-GGAACAGTCTGGGAA-GCTCT-3′；GAPDH 上游引物：5′-TGACCACAGTCCATGCCATC-3′，下游引物：5′-GACGGACACATTGGGGGTAG-3′。

1.2.6Western blot 提取腎皮質總蛋白，用BCA試劑盒檢測各組大鼠腎皮質總蛋白濃度并調平。10% SDS-PAGE分離各組蛋白并轉移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜2 h，隨后滴加Caspase-1 (1∶1 000)一抗，于4℃封閉過夜。第二天棄去一抗，加入HRP標記的山羊抗小鼠二抗室溫封閉1 h后滴加ECL顯色液進行曝光顯影。

2 結果

2.1五味子甲素對大鼠腎臟功能的影響 為了探究五味子甲素對失血性休克大鼠腎臟功能的影響，我們檢測了各組大鼠血清中Scr和BUN的含量。實驗結果表明，與對照組比較，模型組大鼠血清BUN和Scr的含量明顯升高(P<0.01,P<0.001,圖1)；五味子甲素40 mg/kg組和五味子甲素80 mg/kg組大鼠血清BUN和Scr的含量較模型組比較明顯降低(P<0.05,P<0.01,圖1)，表明五味子甲素可促進失血性休克大鼠腎臟功能的恢復。

2.2五味子甲素對腎臟線粒體功能的影響 實驗結果表明，失血性休克能顯著降低大鼠腎臟線粒體SDH、SOD和GSH-Px的活性(P<0.05,圖2)；五味子甲素(80 mg/kg)可明顯升高失血性休克大鼠SDH、SOD和GSH-Px活性(P<0.05,圖2)，表明其可促進失血性休克大鼠線粒體功能的恢復。

2.3五味子甲素對腎臟炎癥反應的影響 qRT-PCR實驗結果表明，與正常組比較，模型組大鼠腎臟皮質IL-1β和TNF-α的mRNA水平明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05,圖3)；五味子甲素80 mg/kg組大鼠IL-1β和TNF-α的mRNA水平較模型組比較明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05,圖3)，同時，五味子甲素還能顯著降低模型大鼠腎臟IL-1β和TNF-α的蛋白表達水平(P<0.05,P<0.01，圖4)，表明其可抑制失血性休克大鼠腎臟炎癥反應。

圖1 五味子甲素對大鼠腎臟功能的影響Fig.1 Effect of Sch A on renal function of model ratsNote: n=8,**.P<0.01,***.P<0.001 vs control group;#.P<0.05,##.P<0.01 vs model group.

圖2 五味子甲素對腎臟線粒體功能的影響Fig.2 Effect of Sch A on mitochondrial function of kidneyNote: n=8,*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs model group.Each experiment was repeated at least three times.

圖3 五味子甲素對IL-1β和TNF-α的mRNA表達水平的影響Fig.3 Effects of Sch A on mRNA levels of IL-1β and TNF-αNote: n=8,*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs model group.

2.4五味子甲素對NLRP3炎癥小體活化的影響 為了探究五味子甲素對NLRP3炎癥小體活化的作用，我們采用Western blot法檢測了NLRP3炎癥小體活化標記因子Caspase-1的蛋白表達水平。模型組大鼠Caspase-1的表達水平較正常組比較顯著升高(P<0.05,圖5)；五味子甲素 40 mg/kg組和五味子甲素 80 mg/kg組Caspase-1的蛋白表達水平與模型組比較明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05,P<0.01,圖5)。結果表明，五味子可抑制失血性休克大鼠NLRP3炎癥小體的活化。

圖4 五味子甲素對IL-1β和TNF-α蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of Sch A on protein levels of IL-1β and TNF-αNote: The protein levels were determined by Western blot.GAPDH was used as losding control.n=8,*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05,##.P<0.01 vs model group.

圖5 五味子甲素對NLRP3炎癥小體活化的影響Fig.5 Effect of Sch A on activation of NLRP3 inflammasomeNote: n=8,*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05,##.P<0.01 vs model group.

3 討論

腎損傷是失血性休克的常見并發癥[2,3]。腎損傷早期主要是短暫的腎臟功能改變，若不能及時恢復血流供應將會導致腎臟出現缺血性壞死，最終導致腎臟器質性病變[14]，但腎血流灌注急劇增加也會進一步加重腎損傷[15]。因此，尋找新的藥物促進腎功能的恢復能有效挽救失血性休克患者的生命。本研究通過復制失血性休克大鼠模型探究五味子甲素對失血休克后大鼠血清中BUN和Scr含量的影響。結果顯示，失血性休克模型組大鼠血清BUN和Scr的含量明顯升高，表明失血性休克造成了大鼠腎臟功能損傷。五味子甲素可明顯降低失血性休克大鼠血清BUN和Scr的含量，提示其能緩解失血性休克后腎損傷，發揮腎保護作用。

線粒體功能障礙是導致失血性休克腎損傷的重要機制之一[4]。線粒體功能紊亂可導致活性氧大量產生、能量供應障礙及促細胞凋亡因子的大量分泌[16]。調控線粒體功能紊亂能有效減輕失血性休克誘導的腎損傷[17]。研究表明，白蛋白誘導的線粒體功能障礙可促進人腎小管上皮細胞凋亡[18,19]。中藥提取物白藜蘆醇可通過調控失血性休克引起的線粒體功能紊亂抑制ROS的表達，減輕腎損傷[20,21]。同時，五味子可減輕順鉑引起的腎損傷[22]。五味子甲素可通過調控線粒體功能促進HL-60細胞凋亡[23]。本研究發現，五味子甲素可顯著促進失血性休克大鼠線粒體SDH、SOD和GSH-Px的活性，其中SDH是呼吸鏈的關鍵酶，SOD和GSH-Px可清除過氧化物，抑制氧化應激的發生，促進細胞存活，提示五味子甲素可通過調控線粒體功能障礙減輕失血性休克引起的腎損傷。

炎癥反應是導致是失血性休克腎損傷的另一重要機制，NLRP3炎癥小體是一種重要的炎癥反應啟動因子[24,25]。研究表明，線粒體功能紊亂可促進NLRP3炎癥小體激活[18]。NLRP3炎癥小體的激活還可進一步的促進線粒體功能紊亂，抑制NLRP3炎癥小體的活化可減輕Ang II誘導的線粒體功能障礙[26]。此外，NLRP3炎癥小體可促進Caspase-1活化，從而促進炎癥因子IL-1β、TNF-α等的活化，促進炎癥反應的發生[27,28]。下調NLRP3炎癥小體活化能降低Caspase-1表達水平，因此，Caspase-1常被作為NLRP3炎癥小體活化的標志[29]。研究表明，NLRP3炎癥小體在各類腎病導致腎損傷過程中發揮著重要作用[7,26]。同時，NLRP3也可通過誘導炎癥反應促進失血性休克后多器官功能損傷[30,31]。Xiang等[32]的研究表明，在失血性休克肺損傷中，NLRP3炎癥小體可誘導通過誘導炎癥因子IL-β和ROS的釋放加重肺損傷。抑制NLRP3炎癥小體活化可抑制腎臟炎癥反應，減輕失血性休克大鼠腎損傷[8]。在本研究中我們發現，五味子甲素可顯著下調失血性休克大鼠腎臟IL-1β、TNF-α的mRNA水平，同時能明顯減弱失血性休克對Caspase-1蛋白表達的促進作用，提示五味子甲素可抑制失血性休克誘導的NLRP3炎癥小體的活化，從而抑制炎癥因子的表達，減輕失血性休克大鼠腎臟炎癥反應。

本研究實驗結果表明，失血性休克誘導的腎損傷可導致線粒體功能紊亂、誘導NLRP3炎癥小體活化。五味子甲素可通過抑制NLRP3炎癥小體的活化抑制失血性休克大鼠腎臟炎癥反應、調控線粒體功能障礙，從而減輕失血性休克誘導的腎臟損傷。本研究僅初步探討了五味子甲素對失血性休克誘導的腎損傷的作用，對于其作用機制還需進行進一步研究，從而為失血性休克早期腎損傷的治療提供新的潛力藥物。