以斑馬魚為疾病模型的小分子藥物篩選研究進展?

趙呈天， 賈 碩， 張曉麗

(中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所，山東 青島 266003)

斑馬魚(Daniorerio)是一種硬骨魚，原產于南亞，屬于輻鰭魚綱(Actinopterygii)，鯉形目(Cypriniformes)，鯉科(Cyprinidae)，短擔尼魚屬(Danio)。它是典型的亞熱帶淡水觀賞魚類，體表分布有藍色銀色相間的條紋，類似斑馬身上的條紋，故被稱為斑馬魚。斑馬魚體型纖細，性情溫和，容易飼養，對水質要求不高且生長周期較短，3個月左右達到性成熟。繁殖周期通常在一周左右，一次產卵量可達幾百枚。卵子體外受精，體外發育，其胚體透明，胚胎發育同步且速度快，可以在不損傷胚胎的前提下清晰地觀察斑馬魚胚胎各器官的生長發育情況。

正因為其具備上述這些特點，引起了科學家的廣泛關注。近年來，以斑馬魚為模式動物的科研工作發展迅速，斑馬魚全基因組測序的完成[1-2]極大加速了對其基因功能的深入研究，同時整胚原位雜交技術、以CRISPR/Cas9為代表的基因敲除技術[3]、以反義MO為代表的基因敲降技術[4]和轉基因技術等都可很好的應用于斑馬魚基因功能研究中。研究發現，斑馬魚雖然在器官構造和形態方面與人類不盡相同，但是在細胞和分子水平上與人類十分相似。有研究表明，大約70%的人類基因至少有一個明顯的斑馬魚直系同源物[2]，通過大規模誘變篩選，英國Wellcome Trust Sanger研究所已經建立了超過3 000個與人類疾病相關的基因的突變品系[1]。這些結果表明，斑馬魚不僅是研究脊椎動物發育過程的理想模型，也是模擬人類疾病的良好模型。

1 斑馬魚在小分子藥物篩選中具有非常大的優勢

小分子化學藥物的篩選在近幾年的研究中發展迅速，多種方法被運用到篩選當中。首先是較傳統的體外篩選，包括細菌、酵母和哺乳動物細胞的體外篩選等，這種篩選方法的缺點比較明顯。第一，一些特殊類型的細胞和大多數器官在體外無法培養或重建；第二，體外培養的細胞無法模擬體內細胞外的微環境；第三，體外培養無法模擬疾病的發展過程。為了解決體外藥物篩選的缺陷，研究人員又采用無脊椎模式生物，其中果蠅和線蟲最具代表性。但是無脊椎動物往往缺乏復雜的系統和器官，其形態和結構也與人類相去甚遠，因此只能在一些特定的篩選中發揮作用。與傳統的體外細胞培養以及簡單的無脊椎動物模型(如果蠅和秀麗隱桿線蟲)的小分子藥物篩選不同，斑馬魚提供了一個完整的用于藥物發現的活體脊椎動物系統，兼之其強大的繁殖能力和低廉的飼養成本，使得體內模型的生物學復雜性與高通量篩選的能力結合在一起(見圖1)。同時，因為藥物在體內發揮作用，因此在評估藥物功能的同時還能兼顧藥物毒性。轉基因斑馬魚能夠通過熒光蛋白標記特定的組織器官，因此僅通過熒光檢測就能初步判斷藥物效果，為藥物篩選帶來了很大的便利。

(首先通過交配獲取大量的轉基因或突變體品系胚胎，待發育至特定階段后進行小分子藥物孵育處理，并在發育過程中分析胚胎的多種生物學性狀，如利用高通量設備檢測胚胎基因表達水平，形態發育及行為學檢驗等，確定命中的小分子藥物。之后，再通過哺乳動物模型實驗及臨床試驗進行進一步的藥理學檢驗，最終獲得可用于生產銷售的新型藥物。The transgenic or mutant embryos are first incubated with small molecule drugs for a desired period of interest.Then,the treated embryos are analyzed with different methods,including phenotypic analysis,high-throughput detecting of gene expression level and/or behavioral tests to determine the potential hits.After that,further pharmacological tests can be conducted on mammalian models.If the compound is approved for safety and efficacy,clinical trials will be further conducted to determine whether it can be approved as a new drug.)

圖1 常用斑馬魚小分子藥物篩選流程Fig.1 Small molecule screening strategy for drug discovery using zebrafish model

續表1

疾病Diseases斑馬魚品系Zebrafish lines小分子藥物Small molecule drugs分子機制Molecular mechanisms參考文獻References肝細胞癌Hepatocellular carcinomaTg(fabp10a:pt-β-cat)SP600125、阿米替林(Amitriptyline)、帕羅西汀(Paroxetine)SP600125通過抑制JNK途徑抑制腫瘤發生,阿米替林和帕羅西汀可能通過抑制5-羥色胺途徑發揮作用。[22]乳腺癌Mammary cancerTg(cldnb:EGFP)大黃素(Emodin),SU6656,RBI抑制原癌基因Src途徑。[23]Tg(kdrl:EGFP)s843IT1t拮抗趨化因子受體CXCR4。[15]脂肪肝Hepatic adiposeinfiltrationWT依澤替米貝(Ezetimibe)和辛伐他汀(Simvastatin)具體機制不明。[27]糖尿病DiabetesTg(tp1:hmgb1-mCherry;pax6b:GFP)霉酚酸(MPA), 戒酒硫(DSF)霉酚酸通過抑制GTP的產生促進β細胞的分化,戒酒硫通過抑制視黃酸信號誘導繼發性β細胞的分化。[28]Tg(ins:PhiYFP-2a-nfsB; sst2: tagRFP)小白菊內酯(Parthenolide)和硫辛酸(Thioctic acid); 帕羅西汀(Paroxe-tine)和阿米替林(Amitriptyline)小白菊內酯和硫辛酸抑制NF-κB通路增強了β細胞的分化,帕羅西汀和阿米替林則是通過5-羥色胺途徑增強β細胞的分化。[29]Tg(lfabp:GAL4-VP16;UAS: nfsB-mCherry)阿立西定(Alexidine)通過抑制PTEN樣線粒體磷酸酶PT-PMT1來降低血糖水平。[30]鐵代謝病Disorders of iron metabolismTg(ubi:Fpn-GFP); pgrmc1 morphants表雄醇(Epitiostanol)、孕酮(Proges-terone)和米非司酮(Mifepristone)增加鐵調素的生物合成來降低鐵轉運蛋白的水平。[32]線粒體病MitochondriopathyWT普羅布考(Probucol)抑制mTORC1信號,激活AMPK和PPAR通路信號。[35]Dravet 綜合征Dravet syndromescn1 mutants芬氟拉明(Fenfluramine)調節5-羥色胺信號通路[37]癲癇 Epilepsykcna1 morphants伏立諾他(Vorinostat)組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑[38]肌肉疾病Myopathiesher1、hes6 mutantsSB225002,XRP44XSB22502抑制斑馬魚中的趨化因子受體Cxcr2功能,XRP44X可以影響Ras-Elk信號傳導途徑,并抑制微管聚合。[39]骨質疏松OsteoporosisWTRWJ-60475, 鹽酸左旋咪唑(Levami-sole HCL), 鹽酸四咪唑(Tetramisole HCL), 氰戊菊酯 (Fenvalerate), NSC-663284, BML-267酯(BML-267ester); BML-267, 潘它米丁(Pen-tamidine)。調節破骨細胞和BMP相關途徑。[40]

2 斑馬魚作為疾病模型在藥物篩選中的應用

相對于其他脊椎動物而言，斑馬魚具有低成本、短周期、便于高通量篩選等顯著優勢，目前已經被應用于藥物篩選的多個方面(見表1)，下面介紹一下斑馬魚作為不同疾病模型的藥物篩選研究進展。

2.1 循環系統疾病

心臟病是一種常見的循環系統疾病，大多無法徹底治愈且經常復發，給患者和社會造成了很大負擔。研究表明，增強心肌細胞的增殖能力，使心臟具有再生潛能可能是一種有效的治療方式。最近，Magadum等篩選出一種誘導心肌細胞增殖的小分子—carbacyclin，并利用斑馬魚、小鼠等研究表明該小分子可以通過激活PPARδ/ PDK1 / p308Akt /GSK3β/β-catenin通路促進心肌細胞再生[5]。

在造血方面，雖然斑馬魚與人類造血的部位不盡相同，但在基因調控方面仍然保持著較高的同源性。2007年，Zon課題組報道了他們的研究成果：通過藥物篩選，他們發現增強前列腺素E2(Prostaglandin E2)合成的化合物能夠增加造血干細胞的數量，并且前列腺素E2本身也能夠增加斑馬魚和小鼠中造血干細胞和多能祖細胞(Hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs)的數量，調節造血干細胞的體內平衡[6]。后來的研究表明，前列腺素E2及其衍生物在促進臍帶血細胞移植后造血干細胞增殖上也發揮重要作用[7-8]。2015年，Zon課題組通過構建HSPCs特異的轉基因斑馬魚品系，篩選出TGF-β受體抑制劑SB-431542以及石蒜堿(Lycorine)等促進HSPCs增殖的小分子化合物[9]。同年，Li等使用斑馬魚全腎骨髓(Whole kidney marrow, WKM)移植的方法，將帶有熒光的斑馬魚全腎骨髓細胞移植入經過亞致死劑量照射的casper突變體中，通過觀察熒光強度來確定藥物是否有效，經過篩選發現環氧二十碳三烯酸(EETs)可以有效的增加植入骨髓細胞的數量[10-11]。這些研究都表明，斑馬魚作為疾病模型在循環系統的藥物篩選方面發揮了重要作用。

2.2 癌癥

癌癥是當今社會人類健康的最大威脅之一，有關癌癥藥物的研發一直是人們關注的重點。斑馬魚作為人類癌癥模型已廣泛的應用于藥物篩選中，包括黑色素瘤[12]，白血病[13]，結腸癌[14]，乳腺癌[15]等。

黑色素瘤是一種皮膚癌，除了家族遺傳，基因突變以外，過度暴露于陽光和紫外線也是發病的主要原因，其中轉移性黑色素瘤有著較高的致死率[16]。White等利用轉基因Tg(mitf-BRAFV600E;p53-/-)品系構建了黑色素瘤的斑馬魚動物模型，發現黑色素瘤形成過程中存在神經嵴祖細胞分化異常的現象，而二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)抑制劑, 如來氟米特(Leflunomide),可以抑制神經嵴發育和黑色素瘤的生長[17]。基于這個發現，2016年，同課題組的Tan等將轉錄延長調節因子HEXIM1成功鑒定為黑色素瘤抑制因子[18]。Dang等采用了對成年斑馬魚口服灌胃技術，篩選抑制黑色素瘤生長的藥物，通過研究發現，使用BRAFV600E特異性抑制劑維羅非尼(Vemurafenib)以亞致死劑量給藥2周，可對約65%個體的腫瘤生長產生抑制效果[19]。最近，Kim等篩選出了一批能夠誘導黑色素瘤細胞增殖分化的微環境因子，其中內皮素3(EDN3)及其合成酶ECE2能夠強烈的促進黑色素瘤的轉移性生長，而CRISPR介導的EDN3和ECE2的失活能夠顯著增加患黑色素瘤動物的存活率[20]，該結果表明微環境在轉移性黑色素瘤分化中的重要功能，也為這一惡性腫瘤的治療提供了潛在靶點。

β-catenin是Wnt信號通路中的一個重要成員，編碼β-catenin的CTNNB1基因突變是肝細胞癌的主要特征之一[21]，Evason等利用Tg(fabp10a:pt-β-cat)轉基因斑馬魚，發現SP600125、阿米替林(Amitriptyline)和帕羅西汀(Paroxetine)能夠抑制β-catenin誘導的肝臟生長，其中阿米替林還在小鼠肝癌模型中有一定的治療作用[22]。

癌細胞的轉移是癌癥發展過程中的重要一步，斑馬魚側線原基細胞在發育中的遷移過程可以部分模擬腫瘤細胞的轉移。Gallardo等利用斑馬魚Tg(cldnb:EGFP)轉基因品系特異標記側線原基細胞，篩選出了165種無明顯毒性且干擾側線原基遷移的小分子藥物，包括三種與神經嵴細胞遷移相關的Src信號通路抑制劑：大黃素(Emodin)，SU6656和RBI。進一步研究發現，在小鼠中SU6656也具有抑制乳腺癌細胞轉移的作用[23]。

腫瘤異質性(Tumor heterogeneity)[24]是癌癥治療的一大難題，即使是相同基因組相同克隆的腫瘤細胞也會產生對治療的不同反應[25]，因此，對待不同的癌癥患者可能也要采取不同的治療方案。小鼠異種移植是體內評估腫瘤異質性的良好手段，但由于其生長所需時間及高額的成本，使得這種方法在臨床中并不實用。斑馬魚胚胎具有透明度高、生長周期短和飼養成本低的特點，利用斑馬魚研究人類腫瘤細胞異種移植是研究腫瘤異質性的良好方法。目前，已經有科學家利用異種移植構建出了斑馬魚三陰性乳腺癌模型，篩選到了一種有效的CXCR4拮抗劑IT1t，它能夠阻礙三陰性乳腺癌的早期轉移[15]，同時也證明了異種移植的有效性。后來，Fior等用親脂性染料(DiI)標記人類腫瘤細胞并注射到受精48 h后的斑馬魚胚胎卵黃細胞間隙中，在注射4 d后，幾乎所有的細胞系都有70%以上的植入率。用5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)標記了正在進行DNA復制的細胞后，發現植入的人類腫瘤細胞處于活躍增殖狀態。接下來，他們將人腫瘤細胞注射到標記血管系統的Tg(fli：EGFP)轉基因斑馬魚品系中，發現這些腫瘤細胞聚集區域形成類似人類腫瘤的血管系統[14]。這些實驗結果證明人腫瘤細胞在斑馬魚異種移植中保持其無限增殖及腫瘤生成潛力。

2.3 代謝疾病

斑馬魚同樣可以作為重要的代謝疾病模型[26]。脂肪肝是一種肝臟代謝綜合征，可進一步發展為肝硬化或者肝細胞癌。隨著人們生活水平的不斷提高，脂肪肝的發病率也在逐漸上升，了解脂肪肝發病的分子機制，篩選到能夠治療脂肪肝的小分子藥物，其意義十分重大。研究人員對高脂肪(HF)飲食和高脂肪加高膽固醇(HFC)飲食喂養的斑馬魚幼魚進行比較，模擬了肝脂肪變性的疾病模型，并驗證了依澤替米貝(Ezetimibe)和辛伐他汀(Simvastatin)這兩種藥物具有改善HFC誘導的肝脂肪變性的功能[27]。

人類的1型糖尿病是由于胰島β細胞的T細胞依賴性破壞引起的。有研究表明，哺乳動物中的胰島β細胞具有再生能力，調節血糖穩態的一種方法就是誘導胰島β細胞的內源性再生。Rovira等利用Tg(Tp1:hmgb1-mCherry)和Tg(pax6b:GFP)的雙轉基因斑馬魚，跟蹤了次級胰島(Secondary islets)的形成及β細胞的早期分化過程，并篩選到了兩種促進胰島β細胞分化的藥物(MPA和DSF)，其中霉酚酸(MPA)通過抑制GTP的產生發揮功能，而戒酒硫(DSF)通過抑制視黃酸(RA)信號誘導次級胰島的早期分化[28]。后來，Wang等同樣得到了兩類促進β細胞分化的小分子，其中I類的小白菊內酯(Parthenolide)和硫辛酸(Thioctic acid)通過抑制NF-κB通路增強β細胞的分化，而II類的帕羅西汀(Paroxetine)和阿米替林(Amitriptyline)可能通過激活5-羥色胺通路促進β細胞的分化[29]。Nath等則是篩選到了一種在斑馬魚體內有效的小分子降糖劑阿立西定(Alexidine)，并用其他藥理學和遺傳手段鑒定出阿立西定通過抑制PTEN樣線粒體磷酸酶PTPMT1來降低斑馬魚體內的葡萄糖水平[30]。

鐵調素(Hepcidin)是由肝細胞產生和分泌的一種小分子激素，在調節體內鐵代謝的過程中發揮重要作用。鐵調素水平升高，會導致低鐵血癥，相反則會引起高鐵血癥[31]。Li等在斑馬魚中篩選到3種類固醇分子：表雄醇(Epitiostanol)、孕酮(Progesterone)和米非司酮(Mifepristone)，它們可以增加鐵調素的生物合成來降低鐵轉運蛋白(Ferroportin)的水平，從而進一步影響體內鐵元素水平，是治療鐵代謝疾病的候選藥物[32]。

線粒體呼吸鏈(Respiratory chain,RC)疾病是一種異質性和高度病態的能量缺乏癥，臨床表現為嚴重的神經發育異常、心臟病、肌肉相關疾病、腎病、肝病、內分泌紊亂、聽力及視力障礙等[33-34]，目前尚無有效的治療方法。魚藤酮(Rotenone)、疊氮化物(Azide)、寡霉素(Oligomycin)和氯霉素(Chloramphenicol)分別為線粒體酶復合物I，IV，V和線粒體翻譯的抑制劑，它們都是線粒體呼吸鏈毒素，Byrnes等利用這四種化合物建立了斑馬魚線粒體功能障礙模型，篩選到普羅布考(Probucol)能夠預防魚藤酮誘導的腦死亡，并能顯著的挽救魚藤酮或寡霉素暴露下的早期胚胎發育延遲[35]。

2.4 神經疾病

與其他治療領域的藥物相比，神經類疾病的候選藥物在臨床試驗中表現出較高的失敗率，這可能是由于血腦屏障的存在和神經性疾病的多基因性。最近，Bruni等報導了一種可用于神經藥物篩選的斑馬魚行為學分析方法：首先，利用已知的神經藥物(如氟哌啶醇，Haloperidol)對7 d大小的斑馬魚幼魚進行處理，然后利用不同波長和頻率的聲覺和視覺組合對處理組及對照組幼魚進行刺激，依據其行為學差異建立起該神經藥物的功效參考體系。最后，依據該參考體系篩選具有類似效果的小分子化合物。作者通過該篩選系統，鑒定出了Finazine等小分子，并在體內證明其發揮類似于氟哌啶醇的藥理作用，表明這套分析方法可用于具有類似機制的神經活性化合物的篩選[36]。

此外，Dinday等利用斑馬魚scn1突變體構建了一種癲癇性腦病—Dravet 綜合征的動物模型，并利用小分子篩選鑒定出包括芬氟拉明(Fenfluramine)在內的多種抗癲癇潛在藥物[37]。最近，Ibhazehiebo報道了一種組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑伏立諾他(Vorinostat)，這種藥物能同時減少斑馬魚和小鼠模型中癲癇發作的頻率，并提出同時抑制HDAC1和HDAC3可能是一種新的癲癇治療的模式[38]。

2.5 肌肉和骨骼疾病

肌肉是人體重要的運動器官，肌纖維的形成與微管有非常密切的關系，微管異常可能導致各種肌肉相關疾病。Richter等結合原位雜交和突變體表型分析方法，篩選了影響體節分化的重要信號分子，鑒定出影響肌節邊界形成的重要小分子—SB225002，而另一種小分子—XRP44X，則通過影響微管的穩定性，進而影響肌肉細胞的伸長和功能[39]。

骨骼的形成是一個動態平衡的過程，包括成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收，這個平衡如果被打破就會出現一系列骨疾病，包括骨硬化、石骨癥和骨質疏松癥等。Chen等開發了斑馬魚抗骨質疏松藥物的快速篩選方法，利用鈣黃綠素(Calcein)作為骨礦化評估的染料，篩選到兩種增加骨礦化的化合物：潘他米丁(Pentamidine)和BML-267，而另外六種化合物RWJ-60475，鹽酸左旋咪唑(Levamisole HCL)，鹽酸四咪唑(Tetramisole HCL)，氰戊菊酯(Fenvalerate)，NSC-663284和BML-267酯(BML-267ester)對骨礦化有抑制作用[40]。

此外，斑馬魚還被用作多囊腎[41]、視網膜變性[42]、背腹發育異常[43]等多種疾病模型應用于小分子藥物篩選，本文不再一一贅述。

3 結語

目前為止，研究人員已經構建出多種轉基因斑馬魚和突變體，這些都將成為良好的人類疾病模型，利用這些疾病模型進行藥物篩選的優勢非常明顯，首先可以非常清楚的觀察到斑馬魚體內組織器官的前后變化，對藥物效果進行合理評估；其次，可以在活體內進行藥物毒性和副作用的初步評估；再者，可以為后續高等動物的臨床試驗提供參考，降低成本和工作量。當然，這種篩選方法也存在著缺點。第一，目前斑馬魚表型主要通過人工觀察，對于藥物命中效果的界定比較困難。第二，雖然斑馬魚基因與人類相似度較高，但是實際編碼的蛋白存在著一定差異，這也就意味著部分適用于斑馬魚的藥物在人類體內不能達到預期效果。總的來說，斑馬魚作為疾病模型在藥物篩選上的應用前景非常廣闊，相信隨著科學技術的進一步發展，將會有越來越多的藥物被篩選出來，為人類醫學研究做出巨大的貢獻。