間充質干細胞在急性肺損傷治療中的研究進展

姜芝峰，張 琳,2，申 捷,2*

1.復旦大學附屬金山醫院急救和重癥監護中心，上海 200540 2.復旦大學化學傷害急危重醫學研究中心，上海 201508

急性肺損傷(acute lung injure,ALI)是指由多種因素引起肺泡上皮細胞受損、肺間質毛細血管通透性改變、肺泡和毛細血管屏障被破壞等病理改變，造成肺泡和肺間質的水腫與炎性細胞浸潤，臨床上以逐漸加重的呼吸窘迫和難治的低氧血癥為主要表現的一種疾病[1- 2]。急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是急性肺損傷發展至嚴重階段，定義為在大于等于5 cmH2O的呼吸末正壓的情況下，動脈氧分壓與吸入氧分數的比值小于等于300 mmHg，同時在胸片上出現雙側浸潤，并且不能完全由心力衰竭或液體超載來解釋[2]。目前對于ALI/ARDS的臨床治療主要是通過呼吸機改善患者的呼吸情況來提高患者的生存率，對于不同程度的ARDS患者所需要指定的策略應該不同，特別是中重度患者[3]。但是對于早期對于患者疾病嚴重程度的分級有許多困難[3]，而且這是一種侵入性的治療方式。

科學家們希望通過服用藥物這種非侵入方式來改善ARDS患者的生存率。不過，無論是抗炎藥物(例如：皮質類固醇[4]、中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑[5])還是想要改善肺自身的藥物(例如吸入性β激動劑[6])都不能有效降低急性肺損傷的死亡率，所以在實際的臨床治療中仍是以機械通氣治療為主。

干細胞是一種具有多向分化潛能和自我更新能力尚未成熟的細胞。鑒于干細胞治療在動物急性肺損傷模型中顯著的效果而得到許多學者的關注。其中，間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)更是因為其來源廣泛、易于提取和分離、無需考慮倫理因素及免疫排斥反應，正用于大量實驗中[7]。

1 間充質干細胞的性質

MSCs存在于多種組織之中，具有一定的自我更新和分化能力并且在多次傳代的過程中其主要特征不會改變。在特定的情況下，具有分化為特定細胞的能力，例如：脂肪細胞、骨細胞和軟骨細胞等[8]。雖然MSCs在人體內的具體的解剖位置還不得而知，但是，近來有研究[9]指出MSCs可以通過抗CD90單鏈抗體來進行特異性檢查。

與此同時，不少研究[7]表明MSCs可以被特定的物質或者環境激活并歸巢到組織損傷的部位，在損傷處分化為新的組織細胞并且修復損傷。與同樣具有多向分化能力的多能干細胞相比，雖然MSCs的分化程度較低，但是其有著不會成瘤、無需考慮倫理因素的優勢。同時，易于分離也是MSCs廣泛存在于各類實驗的主要原因之一，實驗人員可以從羊水和胎盤中分離MSCs[10]，甚至可以從牙髓中獲取類似的牙髓干細胞[11]。

MSCs已經被證明了對于免疫細胞還有免疫因子都有一定的作用，例如：抑制T細胞增殖、誘導巨噬細胞分化為M2抗炎癥型、調節樹突狀細胞的成熟還有調節白介素等[12]。MSCs對于損傷部位的修復也有一定的促進作用。正是由于這些特點，MSCs也被用于ALI的治療。在物理因素、化學因素、生物因素等誘導的ARDS動物模型中，MSCs表現出明顯緩解肺部的炎癥、抑制肺水腫的發展、減輕肺損傷等功能，并且降低了動物的死亡率[13]。在近期開展的少量樣本的臨床試驗中研究[14]顯示，MSCs對于ARDS患者具有一定的治療效果且沒有明顯的不良反應。在一項納入9名確診為ARDS患者的臨床Ⅰ期實驗中，對隨機分為三組的患者分別使用低劑量(1×106/kg)、中劑量(5×106/kg)和高劑量(1×107/kg)的異體骨髓MSCs試劑，未發現MSCs可治療相關不良反應，且有進行Ⅱ期臨床研究的計劃，來進一步評價MSCs對ARDS的療效[15]。

2 間充質干細胞的治療機制

2.1 歸 巢 歸巢是指細胞到達它們可以發揮局部功能的組織的過程，在之前的研究就有證明，MSCs可以有選擇性地到達損傷的部位而不是特定的組織[16]。MSCs需要到損傷部位才能發揮它的功能，所以可以推測，MSCs的向肺損傷部位的歸巢是整個治療的第一步。

MSCs的歸巢是一個復雜的過程，由流動細胞與靶組織血管內皮細胞相互作用、趨化因子激活整合素粘附、緊密結合和外滲四個步驟組成[16]。有許多因素影響這個過程，其中比較重要的因素有：

(1)炎癥因子：在體外實驗中[17]，發現炎癥部位的炎性趨化因子的濃度升高與MSCs的優先遷移至這些部位是有關系的。全身和局部炎癥狀態是影響間充質干細胞歸巢的重要因素。

(2)整合素：整合素在白細胞的遷移、趨化和粘附起關鍵作用，VCAM-1是整合素α4β1,β1和α4β7的內皮配體，有實驗[18]證實大鼠的MSCs可以通過抗VCAM-1抗體的作用而與微血管內皮細胞的粘附性降低，由此，可以推測整合素在MSCs中也有相類似作用。

(3)SDF-1/CXCR4：在之前的實驗中，就有證明SDF-1/CXCR4參與MSCs的遷移[19]。同時有研究[20]表示，通過提高CXCR4受體的表達，可以提高MSCs對ALI的治療效果，這可能也是通過提高MSCs向肺損傷部位遷移的結果。

(4)其他：在最新的實驗中，研究人員發現MAPK,PI3K-Akt和Jak/Stat信號通路也在干細胞歸巢中有著重要作用[21]。

但是由于實驗結果之間存在矛盾，所以對于MSCs歸巢的機制也不是很明確[16]。但是在實驗過程中，研究人員經常通過改變以上因素來調節MSCs的歸巢能力來影響其治療效果。更好地讓MSCs到達肺損傷部位，是在以后提高療效的過程中，需要面對的一個問題，這或許可以通過對其在歸巢過程的細胞保護和重要蛋白的保護來有所突破。

2.2 免疫調節 在ALI的患者中，損傷部位常常有中性粒細胞和巨嗜細胞浸潤，所以，MSCs對于ALI患者的免疫調節，常常是指對中性粒細胞和巨噬細胞的活性及其分泌的細胞因子的調節。

2.2.1 巨噬細胞 在不同的有毒物質損傷肺部引起ALI后，一開始常為促進炎癥和細胞毒性的M1型巨噬細胞。隨著病程的發展，逐漸出現具有抗炎作用的M2型巨噬細胞，這兩者之間的平衡在一定程度上決定了ALI的炎癥程度和對肺部組織的傷害[22]。MSCs一方面通過對巨噬細胞氧化磷酸化的加強來促進M2型巨噬細胞的表達，提高抗炎的作用減小損傷，另一方面，MSCs通過細胞外介導的囊泡來轉移自身的線粒體到巨噬細胞中來增加它的抗炎能力并且提高它的吞噬能力[23]，也有通過微囊泡中的Ang-1基因來調節其免疫功能[24]等。在ALI模型中，MSCs也通過細胞外膜泡進行的線粒體轉移來對巨噬細胞進行調節，這為原本的MSCs調節免疫細胞的機制進行了補充[25]。MSCs源外泌體具有通過調控miR-182來調節巨噬細胞極化進而調節炎癥改善損傷修復的作用[26]。

2.2.2 中性粒細胞 中性粒細胞作為炎癥反應后最早出現的細胞之一，在發生ALI后，向肺損傷部位迅速遷移，并且釋放炎癥因子來吸引更加多的中性粒細胞在損傷的地方進一步聚集，放大炎癥效應，加重炎癥損傷[27]。中性粒細胞對于肺組織的損傷還存在于過量的中性粒細胞胞外殺菌網絡(neutrophil extracellular traps,NETs)的損傷作用。NETs雖然對于肺損傷部位的病原菌清除具有一定的作用，但是過多的NETs由于其中所含有的多種抗菌肽和蛋白酶等物質，對肺組織的上皮細胞還有血管內皮細胞也具有損傷作用，并且有實驗[28]驗證了脫氧核糖核酸酶Ⅰ(Deoxyribonuclease Ⅰ,DNase Ⅰ)來降解NETs來達到減少ALI的損傷程度的目的。同時，也有許多其他方法可以作用于中性粒細胞來改善肺損傷，例如：MSCs的微囊泡的Ang-1基因[24]；MSCs的外泌體對于中性粒細胞的炎癥因子釋放也有抑制作用[29]；MSCs培養基可以誘導LPS引起的ALI的中性粒細胞凋亡[30]。

2.3 損傷部位的細胞修復及保護

2.3.1 上皮細胞 在ALI中，肺泡上皮細胞常常由于各種引起肺損傷的起始損傷因素，后期的過度炎癥反應還有肺部病原菌等造成損傷，上皮細胞間的緊密連接被破壞，導致一些蛋白液的進入，造成肺泡水腫，故對于損傷上皮細胞的修復、保護、替換是一種治療方式。

MSCs對于肺泡上皮細胞的治療機制主要分為兩大類。第一類，MSCs在一定因素的刺激下，轉變為肺泡上皮細胞，例如：在低氧狀態下，由于miR-145的調節導致MSCs向肺泡Ⅱ型上皮細胞轉變[31]。第二類可以認為是MSCs通過各種方式來保護肺上皮細胞，減少受到的傷害，例如：通過旁分泌作用釋放角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)來保護上皮細胞，促進其增殖，也可能促進肺泡Ⅱ型上皮細胞釋放表面活性物質[32]，也抑制ROS和HIF-1α的積累的作用[33]。或者是通過旁分泌出的肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)來維持肺內的HGF的濃度，來進一步修復肺組織損傷并恢復肺組織的滲透性[34]。近期也有研究[35]發現，MSCs與肺泡上皮細胞在分離后共同培養時，會相互誘導產生一個囊狀的三維結構覆蓋上皮細胞，并且這種結構的形成似乎與KGF無關，這可能也會是MSCs保護肺上皮細胞從而緩解、修復肺損傷的機制，還有待進一步研究。也有研究[36]指出，在缺氧狀態下，MSCs通過提高受損氣管上皮細胞內的miR-21來抑制其凋亡,或許在MSCs治療急性肺損傷中也存在相似的過程。

2.3.2 內皮細胞 ALI后的肺部血管內皮細胞損傷也是肺泡和肺間質發生水腫的原因之一。在損傷后，如果可以及時保護血管內皮細胞，或者是促進血管內皮細胞在損傷后修復、增殖，則可以盡可能地維持血管通透性穩定，減少大分子物質滲出，減輕水腫情況。

有研究[37]認為線粒體通過隧道納米管轉運機制(tunneling nanotube mechanism)從間充質干細胞到受損的血管內皮細胞中，恢復其有氧呼吸并且對其有保護作用。也有實驗[38]證實血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為重要的細胞因子對于血管內皮細胞具有一定的修復作用，可以恢復部分的肺通透性。但是在有的研究[39]中發現，通過ACE2來拮抗VEGF可以起到減輕早期的急性肺損傷血管滲透的作用。血紅素加氧酶-1(Heme Oxygenase-1)可以提高MSCs的旁分泌作用并且可以減輕血管內皮細胞炎癥和氧化損傷[40]。

綜上可見，MSCs在對肺泡上皮細胞和血管內皮細胞的修復與保護主要依靠其旁分泌作用和線粒體轉移作用。在將來的研究中，可以將重點放在如何增強MSCs的旁分泌作用和如何促進線粒體高效轉移，來為臨床治療做鋪墊。

2.4 對病原微生物的殺滅 對于已經適當抗菌感染的由膿毒血癥引起的ALI小鼠，同時使用MSCs可以顯著降低死亡率，并且能發現細菌的清除率明顯上升[41]。結果說明MSCs不僅具有殺滅病原微生物的能力，同時這也對特定原因引起的急性肺損傷有治療效果。有研究[42]表明，MSCs分泌LL-37在被拮抗后，MSCs的抗菌能力明顯下降。MSCs也可以通過提高巨噬細胞的吞噬作用來對病原菌進行清除，間接地表現其抗菌的能力。也有一些研究[43]發現，在線粒體DNA結合蛋白TFAM(transcription factor A,mitochondrial)一定程度的缺失，會出現中度的線粒體DNA(mtDNA)應激，能夠刺激干擾素刺激基因的一個亞群，從而達到加強抗病毒的效果。

3 前景與展望

隨著科技的發展，納米技術被更進一步地掌握與利用。鐵基納米顆粒(iron-based nanoparticles,IBNP)具有較好的生物相容性和獨特的磁特性，通常被包裹在細胞或者細胞外囊泡內以實現磁力控制藥物遞送和非侵入性跟蹤[44]。在一項干細胞的研究[45]中，裝有超小型Fe3O4的由干細胞介導的納米微凝膠可以用于腫瘤的成像功能。在ALI中，干細胞具有對于炎癥部位的趨向性，這種納米微凝膠或許可以作為檢測干細胞是否有效到達損傷處的一種方式。以納米為載體轉運藥物可以提高其在生理環境中被降解的速度，增加其作用效果同時減少副作用，這種納米顆粒包裹的藥物與MSCs聯合使用可以起到對MSCs更好地保護作用使干細胞治療效果更加顯著[46]。在近期的研究[47]中，在沒有成骨的補充劑試用下，90 nm包含有生物活性的球形鍶納米顆粒可以促進骨髓來源的干細胞分化成骨，這說明了納米顆粒的具有誘導促進干細胞的分化的作用。這些研究結果有待在ALI模型中再次證實與運用。

與此同時，對于RNA的研究程度也是不斷深入，從miRNA逐漸向LncRNA還有circRNA進軍。在一項涉及circRNA的實驗中[48]，外泌體中被發現存在有大量穩定的circRNA，并且在健康人群和對照組中存在表達差異。在ALI的鼠類模型中，這種circRNA在表達上的差異也被發現與證實，circRNA或許有作為急性肺損傷生物標記物的潛力[49]。更加重要的是，circRNA可以通過對miRNA結合來影響miRNA所控制的下有信號通路，最終對氣管上皮細胞的炎癥和增殖進行調控[50]。但是，在ALI模型中，對于circRNA的研究僅僅處于初始階段，對于circRNA在損傷中有什么作用、作用的機制是什么，目前仍然不清楚，需要進一步探索與研究。

4 總 結

MSCs作為一種具有多向分化、自我更新、免疫應答弱、不存在倫理問題的細胞，在ALI的動物實驗中表現出強大的治療效果，如果通過多種機制的結合對于ALI動物的組織細胞損傷、肺泡、肺間質水腫、潛在的感染等問題一并進行解決，這是十分具有臨床應用潛質的。但是，MSCs本身的特性仍存在疑問，對其治療作用的了解也還不夠深入，這些都有待進一步解決。