嵌合抗原受體-T細胞免疫治療在黑素瘤中的應用進展

鄧心怡，顧建英

復旦大學附屬中山醫院整形外科，上海 200032

腫瘤治療向來是醫學研究的重點，面對手術切除、放化療等傳統治療手段效果不理想的腫瘤，近年基于分子生物學及免疫學發展起來的細胞免疫治療有望成為一種新的強有力的抗腫瘤手段，而嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞)免疫療法也研究熱點之一。通過基因工程技術對T淋巴細胞進行修飾，使其表面能表達嵌合抗原受體。這種受體使細胞不依賴主要組織相容性復合體及抗原提呈細胞對腫瘤抗原的識別和呈遞過程，自身直接識別腫瘤蛋白質及脂類抗原，這一特性使其對腫瘤細胞有很強的靶向識別能力?，F階段CAR-T細胞在臨床上主要用于治療急性B淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、非霍奇金淋巴瘤等血液系統惡性腫瘤[2]。鑒于CAR-T細胞療法在血液系統惡性腫瘤治療中的優秀表現，科學家們也逐漸將研究目光轉向CAR-T細胞在黑素瘤等實體腫瘤治療的運用。雖然目前關于CAR-T細胞療法在實體腫瘤中運用的研究已經取得了一定的進展，但相關實驗結果也暴露出，將CAR-T細胞療法作為一種實體腫瘤標準治療方案尚有相當多的困難需要克服。

1 CAR-T細胞

1.1 CAR-T細胞的特性與機制 CAR-T細胞的功能結構大致由三個部分組成，包括胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域[3]。胞外結構域為一個單鏈可變片段(scFv)，該片段來源于腫瘤特異性抗原的單克隆抗體，對于特定的腫瘤抗原具有較好的靶向識別作用?？缒そY構域為一個共刺激結構域，其中可含有如CD4、CD7、CD8、CD28和CD3ζ等蛋白分子[1]。胞內結構域為一個T細胞免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs)，發揮了信號轉導的作用，將胞外信號傳入細胞內。隨著研究的深入，至今已發展出四代CAR-T細胞，它們的結構大多遵循此模式，其區別主要在于：第一代CAR-T細胞的胞內僅有一個活化基序，而第二代和第三代CAR-T細胞分別在活化基序上添加了一個和兩個共刺激信號分子，使CAR-T細胞識別、活化和抗腫瘤能力的能力得到增強。而第四代CAR-T細胞還在上述結構基礎上增加了至少一個用于編碼嵌合抗原受體及其啟動子的載體，這樣就可以使CAR-T細胞激活的同時產生大量有活性的細胞因子，達到調節腫瘤微環境、增強腫瘤殺傷能力的目的。此種設計賦予了T細胞直接識別腫瘤特異性抗原并自主激活的能力，因此不再依賴主要組織相容性復合體分子及抗原提呈細胞對抗原的呈遞作用。在與腫瘤細胞接觸后，CAR-T細胞即可釋放大量顆粒酶、穿孔素、腫瘤壞死因子等，對腫瘤細胞進行高效殺傷。

1.2 CAR-T細胞的優勢 CAR-T細胞的這種結構使之同時具備了細胞免疫和體液免疫的特點，大大提高了其抗腫瘤效率。大量臨床試驗及運用實例表明，CAR-T細胞主要具有以下優勢：①特異性高：CAR-T細胞表面單鏈可變片段(scFv)的設計源自腫瘤特異性抗原單克隆抗體，因此可通過抗原-抗體識別機制，準確識別腫瘤細胞，有效減少腫瘤免疫逃逸現象[4]。②靶向性強：CAR-T細胞的結構賦予其靶向識別腫瘤特異性抗原的能力，而這些特異性抗原通常情況下并不在正常細胞表面表達，因此CAR-T細胞能對腫瘤細胞進行“精確打擊”。③效率高：CAR-T細胞不需要經過抗原呈遞細胞，并且不依賴MHC對腫瘤細胞進行識別[5]，直接識別腫瘤抗原與之結合，省去了抗原提呈的步驟，大大提高抗腫瘤效率。④覆蓋面廣泛：同起源的腫瘤細胞表面往往表達有相同或近似的腫瘤抗原，因此針對某一特定腫瘤抗原的CAR-T細胞構建完成后便可用于多種表達同一腫瘤抗原的腫瘤的治療，“一藥多用”使得治療效率大大提高。⑤持久性好：CAR-T細胞基于T細胞進行編輯，保留了T細胞增殖活性，輸入體內后可大量增殖并形成記憶T細胞長期存在，因此可在較長時間內維持對腫瘤細胞的持續性殺滅作用。⑥可改變腫瘤微環境：有研究[6]提示，CAR-T細胞可抑制腫瘤微環境中相關抑制性細胞的功能，明顯減少免疫抑制性細胞因子的分泌，改變腫瘤微環境，易于腫瘤殺傷性細胞的后續進入，并抑制腫瘤的增殖，間接增強了其殺滅腫瘤的能力。

2 CAR-T細胞的運用

CAR-T細胞療法是一種具有特異性的過繼性免疫效應細胞治療方法，與傳統腫瘤治療方案如手術切除治療及放化療相比，CAR-T細胞治療具有更精確的靶向性，殺傷腫瘤組織的時，對正常組織的損傷更小，腫瘤殺傷效果維持時間更久等明顯優勢?；贑AR-T細胞的諸多優勢，CAR-T細胞療法有潛力成為一種新的腫瘤治療模式。隨著研究的深入，CAR-T細胞結構不斷得到優化，現已開發出四代CAR-T細胞，并開始將其逐步運用于臨床試驗和治療[7]。

2.1 CAR-T細胞在血液惡性腫瘤中的運用 CAR-T細胞的臨床試驗首先在血液惡性腫瘤中展開。Rosenberg課題組[8]在2010年發表了首篇關于CAR-T細胞的臨床治療結果，該研究提示，通過注射抗CD19分子的CAR-T細胞，晚期濾泡淋巴瘤患者的腫瘤負荷明顯消退，獲得了較長時間的部分緩解。隨后，我國團隊[9]也于2015年至2016年嘗試采用CD19-CAR-T細胞治療了64例難治性復發B淋巴細胞急性白血病患者，取得了良好治療效果?；诹己玫呐R床治療反饋，各大生物公司開始研發CAR-T細胞抗腫瘤藥物，美國食品藥品監督管理局于2017年受理了諾華和凱特制藥兩個公司關于CAR-T療法的申請，授予其“突破性療法”地位，緊接著，全球第一個CAR-T細胞療法上市。該療法早期主要運用于淋巴瘤及白血病的治療，基于良好的治療反饋，近年來也開始嘗試將其用于如黑素瘤、神經膠質瘤等實體性腫瘤的臨床試驗中。

2.2 CAR-T細胞在黑素瘤中的運用 黑素瘤是一種中外胚層神經嵴來源的黑素細胞的高度惡性腫瘤，預后差、治療難度大。以往多采用手術切除治療，但黑素瘤轉移較早，轉移性黑素瘤患者預后極差。據統計，我國遠處轉移黑素瘤患者十年生存率尚不足10%[10]。

黑素瘤細胞攜帶有大量的突變基因序列，其細胞表面表達有大量腫瘤新抗原，這一特性使之容易被免疫系統所識別。基于此特征，科學家們很早便開始在黑素瘤的治療中嘗試應用免疫療法[11]，且取得了不錯的療效。鑒于CAR-T細胞在治療血液惡性腫瘤的嘗試中表現優異，科學家們開始將研究目光轉向黑素瘤的治療。美國國立衛生研究院癌癥研究所癌癥研究中心外科分會于2006年進行了一項實驗研究[12]，使用反轉錄病毒改造正常的循環中的淋巴細胞，使其表達識別黑素瘤分化抗原 (melanoma antigen recognized by T cells 1，MAR T1)的TCR，將此種細胞回輸入患者體內，發現能夠有效介導腫瘤的消退。2014年Christian Krug等[13]以黑素瘤相關硫酸軟骨素蛋白多糖(Melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan，MCSP)作為治療靶點，構建并鑒定了第1、2兩代CAR-T細胞。其抗腫瘤活性鑒定結果提示，兩代CAR-T細胞均可有效殺傷黑素瘤細胞?；己谒亓鲂∈蠼涍^輸注CAR-T細胞，生存期得到了明顯的延長，且此效果在第2代CAR-T細胞中表現得更為顯著。之后在2017年，一項由Efrat等發起的的關于運用過繼細胞療法(ACT)治療惡性黑素瘤的研究[14]顯示：通過回輸VEGFR2-CAR-T細胞而接受過繼細胞療法的24名患者中，緩解率為4%。一系列實驗研究表明，CAR-T細胞過繼細胞免疫療法對于黑素瘤有極大的治療潛力，但目前仍存在一些不可忽視的問題阻礙著此療法的臨床運用。

3 CAR-T細胞療法治療黑素瘤面臨的問題及對策

CAR-T細胞在腫瘤殺傷中所表現出來的各種優勢，使之成為腫瘤治療方面的研究熱點，被認為是腫瘤治療的新方向。通過研究發現，血液系統惡性腫瘤細胞表面攜帶大量腫瘤特異性抗原便于CAR-T細胞的識別，無屏障作用的循環系統使得CAR-T細胞能夠迅速擴散及分布，以及T淋巴細胞的歸巢效應，這些特性賦予CAR-T細胞在治療血液系統惡性腫瘤的運用中的巨大優勢。雖然科學家已經過諸多嘗試，然而目前CAR-T細胞治療實體腫瘤如黑素瘤仍存在許多障礙[14]。

3.1 趨化過程中的物理障礙 黑素瘤為實體性腫瘤，與血液系統腫瘤無屏障作用不同，腫瘤微環境形成的物理屏障對CAR-T細胞是一種阻礙。CAR-T細胞需要從血管中移出，跨越內皮屏障[16]，遷徙至病灶處，隨后需要分泌降解酶，主動降解細胞外基質[17]以到達并接觸腫瘤細胞。以往回輸CAR-T細胞多通過靜脈注射，而對于黑素瘤而言，腫瘤處病灶內注射[18]可有效避免上述物理障礙。另外有研究者設計出表達相應細胞因子受體的CAR-T細胞，使之利用“歸巢”效應定位并遷徙至腫瘤細胞所在部位[19]。

3.2 腫瘤微環境的免疫抑制 實體腫瘤存在腫瘤微環境，這是CAR-T細胞面臨的最重要的障礙之一。腫瘤微環境中存在的基質細胞、調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)等營造了免疫抑制環境，CAR-T細胞的抗腫瘤活性在其中將受到抑制。賓夕法尼亞大學的一個研究小組報道了一種利用免疫抑制細胞因子來規避此影響的策略，他們使CAR-T細胞表達dnTGF-β受體，通過實驗觀察發現，這一措施可增強CAR-T細胞在腫瘤微環境中的存活、分泌細胞因子及腫瘤殺傷的能力[20]。

3.3 腫瘤的免疫逃逸 接受CAR-T細胞治療的患者在最初有效的治療反應后，可能會出現腫瘤的進展，這很可能是由于腫瘤細胞啟動了“免疫逃逸機制”，繞過了現有的免疫識別系統所導致[21]。這些機制包括靶抗原的下調或丟失。黑素瘤為一種高度異質性腫瘤，因此識別單一腫瘤抗原的CAR-T細胞很容易在使用一段時間后出現“脫靶”現象。因此有研究者提出，使CAR-T細胞同時表達2種腫瘤特異性受體的方法來應對此現象[22]。構建串聯CAR 體系(“tandem” CAR，TanCAR)可以降低腫瘤抗原逃逸的概率，如構建表達HER2抗體和IL13Rα2抗體的CAR-T細胞，單個HER2或IL13Rα2就能激活TanCAR，當兩種抗原同時被識別時則能夠產生更強的活性，TanCAR-T細胞能有效增強T細胞抗腫瘤效應，減少腫瘤復發[23]。

3.4 治療相關毒性作用 CAR-T治療的毒性作用主要分為腫瘤靶向毒性和非腫瘤/靶向毒性。腫瘤靶向毒性產生的機制主要是，CAR-T細胞經回輸大量增殖，迅速識別殺傷腫瘤細胞，導致細胞內炎性細胞因子短時間內大量釋放，即引起細胞因子釋放綜合征(cytokine-release syndrome，CRS)。同時，腫瘤細胞大量溶解，細胞內離子釋放入內環境，造成以高鉀、高磷、高尿酸等癥狀為主的腫瘤溶解綜合征(tumor lysis syndrome，TLS)。對于靶向毒性，主要有如下幾種對應方法[5]：①設計CAR時加入可控性自殺基因作為安全開關；②優化CAR-T細胞回輸方案，由少量逐漸過渡，緩慢增加回輸量；③先回輸少量1代CAR-T細胞，待機體適應后改用2代或3代CAR-T細胞增強抗腫瘤效果；④回輸CAR-T細胞的同時注射免疫抑制劑，白細胞介素1、白細胞介素6等細胞因子的拮抗劑能有效防止CRS及緩解已發生的CRS。

非腫瘤/靶向毒性的產生機制為，CAR-T細胞依賴腫瘤表面抗原發揮作用，而它所識別的腫瘤抗原往往不僅表達于腫瘤細胞表面，某些正常細胞表面也可能有不同程度的表達，因此CAR-T細胞識別腫瘤抗原時有可能出現誤差，對健康組織也造成損傷。要解決此類問題，就需要發現特異性更高的腫瘤表面抗原。

4 總結與展望

作為一種新型過繼性免疫細胞療法，CAR-T細胞療法通過數十年的研究已經逐步成熟，目前在血液系統惡性腫瘤的治療中已取得顯著成效，且已經開始了較廣泛的臨床使用。通過上述總結，CAR-T具有高效準確及長期維持等優點，是否可將其用于黑素瘤等實體腫瘤的治療是目前的研究熱點，鑒于其在血液系統惡性腫瘤中的優秀表現，其治療實體腫瘤的潛力不容小覷。但現階段存在的諸多障礙，如腫瘤微環境的物理屏障作用，腫瘤的抗原下調導致脫靶效應，非腫瘤細胞的錯誤識別，治療相關的毒性反應等仍待進一步的研究以克服。相信在不遠的未來，CAR-T細胞過繼免疫療法將更加成熟，有望成為新一代強有力的抗腫瘤手段。