耐藥性癲癇與P糖蛋白的研究進展

癲癇是以腦部神經元異常放電所致的突然、反復和短暫的中樞神經系統功能失常為特征的一種疾病。全球大約有7 000萬人罹患癲癇，我國大約有900萬癲癇病人[1-2]。目前，我國臨床上有近30種抗癲癇西藥，但臨床上約有50%新診斷的病人首次接受藥物治療后，癲癇不能夠得到控制；另有約30%的病人為耐藥性癲癇[3]。2010年國際抗癲癇聯盟對耐藥性癲癇的定義達成共識，一是抗癲癇藥物治療的結局分類：臨床無發作、治療失敗及不確定； 二是在治療失敗的基礎上提出了耐藥性癲癇的核心定義：兩種正確選擇、可耐受的抗癲癇藥，經足夠療程及劑量治療(單藥或聯合用藥)后仍未能控制發作的癲癇[4]。針對癲癇耐藥性發病機制目前存在6種假說：多藥轉運體假說、基因突變假說、藥物靶點假說、藥代動力學假說、神經網絡假說以及疾病自身嚴重性假說[5]。其中多藥轉運體假說于1995年由美國學者Tishler提出，認為多藥轉運蛋白P糖蛋白(P-gp)參與了抗癲癇藥物的跨膜轉運，能夠通過水解三磷酸腺苷(ATP)獲取能量，主動將抗癲癇藥物逆濃度梯度外排出腦組織，降低腦組織中藥物濃度，而引起癲癇多藥耐藥[6]。多藥轉運體假說的提出引起了學術界的廣泛關注與研究。理論上P-gp介導耐藥性癲癇假說的成立應當滿足以下3個前提：第一，癲癇耐藥病人血腦屏障中P-gp高表達；第二，抗癲癇藥物為P-gp作用底物；第三，癲癇耐藥病人腦組織中抗癲癇藥物濃度較藥物敏感性癲癇病人低。本研究就這3個方面進行綜述，為P-gp介導耐藥性癲癇的假說的成立提供可能的科學證據。

1 P-gp概述

P-gp 為ATP 結合盒超家族蛋白(ATP-binding cassette，ABC)成員，分子量約為170 KD。1976年Juliano 和 Ling在秋水仙堿耐藥的中國倉鼠卵巢細胞中發現P-gp。人體中P-gp主要由位于人類第7號染色體 q21.1的多藥耐藥基因1和2(multi-drug resistance gene，MDR)編碼[7]，而嚙齒類動物則有mdr1a、mdr1b和mdr2 3個基因可編碼 P-gp[8]。其中人體中的MDR1與嚙齒類動物的mdr1a、mdr1b功能相同，編碼P-gp參與多藥耐藥。而MDR2與mdr2則主要表達膽小管膽堿轉運蛋白[8-9]。P-gp主要表達于腸道、肝臟、腎臟、血腦屏障以及血胎盤屏障等各類屏障與代謝器官中[10-11]。在正常的腦組織中，P-gp主要表達于血腦屏障腦血管內皮細胞與血腦脊液屏障脈絡叢上皮細胞中[12]。生理狀態下 P-gp 起到阻止外源性毒素入侵，排出內源性有毒物質，維持內環境穩定的作用，是人體中重要的防御機制[13-14]。目前已發現數百種P-gp的作用底物，這些底物廣泛分布于天然藥物、化學藥物、類固醇、熒光染料、環肽以及離子載體中；主要是疏水性和兩親性，多為雜環化合物。一般而言，脂溶性越強的藥物越容易進入腦組織中。臨床上大部分抗癲癇藥物都為脂溶性的，但是仍有1/3的癲癇病人對抗癲癇藥物不耐受[3]。其中可能的原因是癲癇病人血腦屏障中過表達的P-gp將脂溶性的抗癲癇藥物逆濃度梯度排出腦外，降低了腦組織中癲癇藥物的濃度[6]。

2 耐藥性癲癇P-gp高表達

2.1 動物實驗 電刺激建立癲癇持續狀態后顳葉癲癇模型因較易出現自發性癲癇發作而被學者們廣泛使用。在該模型建立急性與慢性期皆存在P-gp的高表達。建立模型7 d后發現，大鼠腦組織中出現mdr1a mRNA、mdr1b mRNA以及P-gp的高表達，同時慢性期大鼠腹側顳葉神經膠質細胞、內皮細胞、顳葉海馬以及海馬旁回中也存在不可逆的mdr1b mRNA與 P-gp的過表達，并且其表達量與癲癇發作次數呈正相關[15-16]。此外，在氯化鋰-匹羅卡品點燃的癲癇持續狀態模型中，大鼠腦組織中可檢測到P-gp的高表達[17-18]。此外，腹腔注射亞劑量戊四氮反復點燃的癲癇大鼠模型海馬與皮層中亦能檢測到高表達的mdr1a mRNA、mdr1b mRNA以及P-gp[19-21]。Lazarowski等[22]反復給wistar大鼠腹腔注射3-巰基丙酸誘發癲癇后，大鼠血腦屏障中P-gp的表達呈進行性增加；另外，給3-巰基丙酸誘發的癲癇模型大鼠腹腔注射苯妥英鈉后，與正常大鼠相比其海馬中苯妥英鈉濃度明顯下降，并且P-gp抑制劑尼莫地平能夠扭轉這種下降。最近，3-巰基丙酸誘發的癲癇模型被選定為抗癲癇藥物臨床前實驗的新模型。經3-巰基丙酸持續誘發23次癲癇后，100%的動物對苯妥英鈉耐藥，80%的動物對苯巴比妥耐藥[23]。給癲癇小鼠模型腹腔注射苯妥英鈉(30 mg/kg)或卡馬西平(15 mg/kg)，每天2次，干預7 d后，小鼠腦微血管內皮細胞P-gp顯著升高[24-25]。每天給大鼠腹腔注射苯巴比妥(30 mg/kg)或苯妥英鈉(30 mg/kg，首劑75 mg/kg)，干預11 d后，各腦區(額葉皮層、頂葉皮層、杏仁核、海馬、齒狀回、梨狀皮質，黑質網狀部和小腦)均未出現P-gp的高表達[26]。相反，馬桑內酯引起的癲癇持續狀態大鼠模型每天經125 mg/kg卡馬西平或187.5 mg/kg丙戊酸鈉灌胃后，大鼠星形膠質細胞、內皮細胞、海馬、顳葉大腦、額葉大腦以及頂葉大腦中均出現P-gp高表達；而給予100 mg/kg托吡酯或125 mg/kg拉莫三嗪干預后并未影響P-gp的表達[27-29]。動物實驗證實，反復進行化學誘導、電刺激以及長時間使用一些抗癲癇藥物能夠誘導癲癇大鼠、小鼠模型腦組織中mdr1a mRNA、mdr1b mRNA以及P-gp的高表達。

2.2 臨床實驗 1995年，美國學者Thishller 對19例難治性局灶性癲癇病人腦組織進行檢測發現，有11例病人癲癇病灶組織中MDR1 mRNA表達水平比自身正常腦組織高10倍；14例病人腦血管內皮細胞中出現P-gp的過表達[6]。Liu等[30]使用免疫熒光技術對癲癇致病灶、硬化海馬以及正常的腦區中P-gp的表達進行半定量分析，發現硬化海馬中P-gp陽性顆粒明顯增多。Lazarowski等[31]對1例對苯妥英鈉、苯巴比妥以及勞拉西泮耐藥的癲癇病人手術切除的致癇灶進行檢測，發現了P-gp的高表達。在難治性癲癇病人顳葉內皮細胞中亦能檢測到過表達的P-gp。Rambeck與他的同事使用圓形微透析探頭對難治性癲癇切除術中的病人癲癇灶組織細胞外液、腦脊液以及血漿中的抗癲癇藥物濃度進行了檢測，發現癲癇灶組織中的抗癲癇藥物濃度明顯比腦脊液中低。這也是首例報道癲癇致病灶抗癲癇濃度的降低關系著耐藥性癲癇的產生[32]。Summers等[33]對1例難治性癲癇病人常規用藥中添加了P-gp抑制劑維拉帕米后，該病人癲癇控制情況以及生活質量明顯改善。臨床實驗表明，耐藥性癲癇病人癲癇病灶與正常腦組織相比，MDR1與P-gp存在高表達，并且癲癇灶組織中的抗癲癇藥物濃度明顯降低；這可能提示某些抗癲癇藥物為P-gp的作用底物。

以上動物與臨床實驗結果可初步推測出以下兩點：第一，癲癇的反復發作以及長時間服用抗癲癇藥物均能夠引起P-gp高表達；第二，一些耐藥性癲癇病人腦組織中確實存在高表達的P-gp。然而既往臨床實驗皆缺乏健康對照組和藥物耐受性對照組，相關結論需要進一步證實。此外，在P-gp高表達的前提條件成立的情況下，高表達的P-gp能夠作用于抗癲癇藥物，對于P-gp介導耐藥性癲癇假說的成立則尤為重要。

3 P-gp與抗癲癇藥物

P-gp能夠主動轉運疏水性和兩親性化合物，而大部分抗癲癇過程依靠平面親脂性分子，所以理論上很多種抗癲癇藥物都應該為P-gp的底物。第1個關于P-gp轉運抗癲癇藥物的實驗是由Tishler完成的。他發現與正常的神經外胚層細胞相比，MDR1高表達的神經外胚層細胞中苯妥英鈉含量顯著降低[6]。這一實驗結果在癲癇持續狀態引起的P-gp高表達的大鼠和mdr1a/b基因敲除的小鼠體內得到證實[24，34-35]。在大鼠腦組織微量透析實驗中，通過微透析探針給予P-gp抑制劑維拉帕米的干預后，顯著地增加了大腦皮層細胞外液中苯巴比妥、拉莫三嗪、非爾氨酯以及奧卡西平的含量。相反，在mdr1a基因敲除的小鼠實驗研究中，僅發現P-gp能夠作用于托吡酯，而對苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平、氨己烯酸、拉莫三嗪以及加巴噴丁無作用[36]。

關于P-gp作用于卡馬西平的實驗研究得到了不同的實驗結論[37]。據Mdr1a/b基因敲除的小鼠體內實驗和體外Caco-2以及人體淋巴細胞羅丹明123集聚實驗結果，Owen 等[38]認為卡馬西平不是P-gp的作用底物。而在大鼠腦組織微量透析實驗中發現，P-gp抑制劑維拉帕米干預后顯著地增加了大腦皮層細胞外液中卡馬西平的濃度。另1項使用mdr1a/b基因敲除的小鼠實驗研究亦得到相似的結論[39]。在單層細胞外排實驗中，發現轉染了人和小鼠編碼P-gp cDNAs的豬與狗腎臟細胞并不能夠轉運丙戊酸鈉[40]。Baltes等[41]使用相同的細胞模型進行了雙向傳輸實驗，表明苯妥英鈉和拉莫三嗪只能夠被小鼠編碼的P-gp轉運。有研究指出由于大部分抗癲癇的藥物為高滲透性，抗癲癇藥物的主動擴散作用可影響P-gp作用于抗癲癇藥物的結果，傳統的雙向傳輸實驗并不是研究P-gp與抗癲癇藥物相互關系的理想模型。因此，他們使用了一種改良的實驗方法，即濃度平衡運輸法。濃度平衡運輸法是指實驗開始即在細胞兩側加上等濃度的抗癲癇藥物，以消除抗癲癇藥物主動擴散作用對P-gp功能的影響。濃度平衡運輸法檢測出苯妥英鈉、苯巴比妥、拉莫三嗪以及托吡酯均能夠被人體編碼的P-gp轉運[42]。Zhang等[43]利用雙向傳輸實驗和濃度平衡運輸法證實了以上結論，并且發現乙琥胺亦是P-gp的作用底物。Verbeek等[44-45]在大鼠體內使用PET示蹤技術研究了苯妥英鈉與P-gp相互關系，發現P-gp對苯妥英鈉有微弱的轉運作用；在同樣的實驗設計里，結果顯示p-gp并不作用于苯巴比妥。目前有關P-gp與抗癲癇藥物的臨床實驗尚缺乏。Marchi等[46]對11例術中的難治性癲癇病人利用液相與紫外技術檢測了其腦組織與血漿中奧卡西平代謝產物10-OHCBZ的濃度；并且使用逆轉錄PCR技術檢測了致癇灶組織中MDR1 mRNA的表達水平，研究發現腦組織與血漿中10-OHCBZ的濃度比值與致癇灶組織中MDR1 mRNA的表達水平呈負相關，隨后進一步顯示了P-gp抑制劑XR9576的干預能夠促進細胞對10-OHCBZ的吸收。

關于P-gp與抗癲癇藥物的相互關系，不同的模型可能得到不同的結果，甚至相反的結論。2012年，Zhang等[47]總結了拉莫三嗪、奧卡西平、卡馬西平、苯巴比妥以及苯妥英鈉是P-gp作用底物，且與P-gp的相互作用關系在體內外多項實驗中獲得證實。

4 小 結

針對癲癇耐藥性發病機制存在多種假說，其中最受關注的為多藥轉運體假說。該假說認為，多藥轉運蛋白P-gp參與了抗癲癇藥物的跨膜轉運，能夠通過水解ATP 獲取能量將藥物逆濃度梯度外排出腦組織，降低腦組織中抗癲癇藥物的濃度，而引起癲癇多藥耐藥。為了論證該假說的成立，學者們進行了大量的臨床與基礎實驗，主要的發現有：①癲癇耐藥病人與耐藥動物模型血腦屏障中存在P-gp高表達 ；②一些抗癲癇藥物為P-gp作用底物，如拉莫三嗪、奧卡西平、卡馬西平、苯巴比妥以及苯妥英鈉等；③癲癇耐藥病人腦組織中抗癲癇藥物濃度較藥物敏感性癲癇病人低。當然，有些實驗設計亦存在不足之處。如臨床實驗缺乏正常腦組織的對照；Mdr1a/b基因敲除的動物中其他轉運蛋白的代償性表達而出現實驗結果的不一致性；細胞模型評價標準的不統一等；這些因素皆影響著該假說的成立，相關實驗應該更進一步的完善補充。有關耐藥性癲癇與P糖蛋白的研究有利于發現新的治療癲癇以及預防和扭轉癲癇耐藥性的方法，值得更深入的研究。