牙周組織工程的研究進展

呂雪雯，潘春玲

（中國醫科大學附屬口腔醫院牙周科，遼寧省口腔醫學研究所牙周病研究室，中國醫科大學口腔醫學院中心實驗室，遼寧省口腔疾病重點實驗室，遼寧省口腔疾病轉化醫學研究中心，沈陽 110002）

牙周病是世界范圍內患病率較高的疾病，在我國，牙周病的患病率居于齲病之上，是成人牙齒喪失的首位原因。健康的牙周組織是口腔各種疾病治療的基礎，越來越多的研究表明，牙周病與全身健康和疾病有著密切的雙向關系。牙周治療的目標是多種牙周組織的再生，包括牙槽骨、牙骨質和牙周膜。非手術性的牙周治療通過清除病原體和壞死組織，可以控制疾病的發展，但只有少量的牙周組織可以在治療部位再生［1］。牙周組織工程是應用細胞生物學和工程學原理，在活體上取得相關的目的種子細胞，體外擴增后，接種到生物相容性好的天然或人工合成的細胞支架上，與此同時，提供生長因子微環境，經過一定時間的體內或體外繼續培養，通過細胞自我更新和細胞間的相互作用，形成具有一定外形、結構和功能的組織或器官，以行使功能的一門技術［2］。

因此，依托牙周組織工程使牙周炎患者獲得牙周組織再生，對口腔健康乃至全身健康有著重要的意義。本文就牙周組織工程的種子細胞、生長因子及支架材料的研究進展進行分析、總結，為深入牙周組織工程研究提供一定參考，從而促進牙周炎患者牙周組織損傷的修復與再生。

1 種子細胞

牙周組織工程中應用的種子細胞主要包括牙源性干細胞、骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）、脂肪來源的干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）等。理想的種子細胞應具備以下特點：收集較為容易，數量較多且增殖分化能力強，取材過程對機體創傷小，植入體內的方式安全有效，移植后無免疫排斥反應且可按照預期分化等。

1.1 牙源性干細胞

目前，已從牙體、牙周組織中成功分離并培養出的相應的牙源性干細胞有牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）、牙髓干細胞、脫落乳牙干細胞、根尖乳頭干細胞、牙齦間充質干細胞、牙囊細胞等［3］。

其中，PDLSCs是牙周治療后形成牙齦與牙根面新附著的主要細胞來源，對牙周組織重建有著至關重要的作用，PDLSCs已成為牙周組織工程的首選種子細胞［4］。PDLSCs不僅具有很強的自我更新能力和多向分化潛能，能被誘導生成成骨細胞、成牙骨質細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、軟骨細胞及神經元細胞等，還可通過旁分泌作用發揮免疫調節作用［3］。2004年，SEO等［5］通過酶消化法從健康成年人的牙周組織中分離出具有易體外擴增和克隆能力的細胞，首次提出了人牙周膜干細胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）的概念。近期，PIZZICANNELLA等［6］的研究評價了hPDLSCs的行為。異種移植顆粒（G）是一種來源于牛松質骨的完全脫蛋白的羥基磷灰石陶瓷支架，將含和不含G的hPDLSCs培養24 h～1周，結果提示，G不僅是一種具有足夠生物相容性的三維生物材料，而且也是miR-210和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的有效誘導劑，而miR-210參與VEGF的分泌，可以在骨再生的早期階段提供一個新的調節系統。誘導hPDLSCs 產生這種生長因子，可在骨整合的第一階段用于誘導生物材料周圍血管的生長。因此，hPDLSCs/G結構可以作為一種有希望的策略來預制帶血管的骨段移植到缺損部位。NAGATA等［7］的研究指出，由于在各種疾病模型中種子細胞移植后細胞存活率較低，其旁分泌功能作為一種再生機制受到越來越多的關注。研究人員利用大鼠牙周組織缺損模型，研究PDLSCs移植條件培養液在支持牙周組織中的再生潛能。采用超濾法從PDLSCs和成纖維細胞中提取無細胞的條件培養液，移植到手術造成的牙周缺損中。PDLSCs-條件培養液移植以濃度依賴性方式促進牙周組織再生，而成纖維細胞-條件培養液沒有顯示任何再生功能。蛋白質組學分析表明，PDLSCs-條件培養液中含有細胞外基質蛋白、酶、血管生成因子、生長因子和細胞因子。此外還發現PDLSCs-條件培養液通過抑制腫瘤壞死因子-α產生的炎癥反應而促進牙周再生，因而PDLSCs-條件培養液移植可成為牙周再生治療的新途徑。

1.2 BMSCs

BMSCs具有豐富的來源，取材較為簡便，對機體的損傷小，且具有較強的增殖能力和分化能力。MU等［8］研究了豬的自體無支架間充質干細胞片移植到口腔牙槽骨表面以刺激局部骨生長的可行性和有效性，結果表明了豬的下頜BMSCs可制備成細胞片，自體BMSCs移植到拔牙處骨膜下頰側牙槽骨表面，可增加局部骨密度。REZAEI等［9］研究了3種關鍵再生因子——富血小板血漿、犬BMSCs和纖維蛋白膠，對牙周組織再生的影響。實驗共選取5只犬，每只犬在5顆牙齒的頰面上建立Ⅱ級分叉缺陷，發現并闡明了不同類型的新骨和牙骨質、新牙骨質和牙周膜的最大厚度、骨的活力以及炎癥或異物反應的存在，證明了BMSCs在牙周組織工程中具有良好的應用前景。

1.3 ADSCs

脂肪組織來源豐富，其內由大量脂肪細胞組成，容易分離。可以通過抽脂術提取ADSCs，該術式對人體損傷小、風險低、痛苦少［10］。并且ADSCs體外培養易存活，增殖活性強，傳代多次后仍能維持向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等分化的多向分化潛能。鑒于以上優點，ADSCs成為牙周組織工程發揮重要作用的種子細胞之一。MOHAMMED等［11］提出，在許多情況下，牙周基礎治療的價值有限，因此采用輔助治療來提高其療效。ADSCs/基質細胞在牙周組織再生研究中取得很好的結果，外顯子是介導干細胞/基質細胞作用的細胞外囊泡。用結扎法誘導50只大鼠牙周炎14 d，并將其分為對照組、牙周基礎治療組、ADSCs組和外顯子組。結果顯示，外顯子和ADSCs都能夠形成新組織，外顯子組在4周內獲得了與正常健康組織相當的牙周組織，說明了ADSCs/基質細胞及其外顯子是牙周基礎治療的一種有希望的輔助治療。

2 生長因子

生長因子是一種具有牙周組織修復功能的多肽類蛋白質，具體表現在促進細胞的生長、增殖、分化、趨化、新陳代謝等。牙周組織工程中重要的生長因子主要有血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）、骨形態發生蛋白、釉基質蛋白衍生物等。

2.1 PDGF

血小板衍生生長因子是貯存于血小板α顆粒中的一種堿性蛋白質。THOMA等［12］的觀察了2種生物介質——重組人骨形態發生蛋白-2和重組人血小板源性生長因子在誘導犬骨缺損再生中的作用，并根據組織形態計量學指標與對照組進行比較。研究表明，與對照組相比，2種生物介質在一定時間內均能增加骨再生的數量，但在超過一定時間后，由于硬組織重塑過程的增強而不能增加骨再生量。KAVYAMALA等［13］比較和評價了重組人血小板源性生長因子和磷酸三鈣共同作用與單純磷酸三鈣骨移植技術在治療骨缺損患者時的再生潛能。結果顯示，2組中所有參數都有明確改善，但共同作用組顯示出更加明顯的改善效果。因而表明，PDGF在治療人牙周骨內缺損中具有重要作用。

2.2 bFGF

bFGF是一種屬于肝素結合家族的多肽生長因子，具有促進細胞黏附、增殖、分化，促進創傷愈合，參與組織損傷的再生及修復等多種生物學作用，與牙周組織再生有密切關聯。COLENCI等［14］在體外評估了bFGF在犬BMSCs增殖和表達Ⅰ型膠原和纖維蛋白中的作用，并與犬牙周成纖維細胞的表達進行比較。結果表明，bFGF刺激后，BMSCs增殖增加，纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原表達也有所增加。OGAWA等［15］研究了負載成纖維細胞生長因子-2的納米β-磷酸三鈣/Ⅰ型膠原支架對生物活性的影響，特別是對牙周組織創面愈合的影響。結果顯示，含有成纖維細胞生長因子-2的納米β-磷酸三鈣支架更有利于牙周組織再生。

2.3 TGF-β

TGF-β是一種具有多種調節功能的生長因子，能夠促進細胞黏附、生長，誘導DNA和纖維蛋白的合成，調控成骨分化，在牙周組織工程領域有重要應用。譚榮邦等［16］研究了TGF-β1與IGF-1在體外誘導BMSCs定向分化為軟骨細胞中的作用，結果表明，單獨使用TGF-β1或聯合使用TGF-β1和IGF-1可以誘導BMSCs定向分化為軟骨細胞。但單獨使用IGF-1不能誘導BMSCs定向分化為軟骨細胞。龍晏等［17］研究了TGF-β1對PDLSCs增殖和遷移能力的影響及作用機制，結果表明，TGF-β1可以激活Notchl信號通路，促進人PDLSCs的增殖和遷移。

2.4 IGF

IGF是胰島素家族的一類多肽生長因子，可促進細胞的遷移、增殖、分化，誘導膠原和基質合成，參與牙槽骨形成，是牙周組織改建的重要因子。徐皚等［18］的研究表明，IGF和TGF-β單獨或聯合作用均能促進人牙髓干細胞的增殖，且IGF可促進牙周膜細胞的成骨分化，在牙周組織改建中發揮重要作用。屈俊秀等［19］的研究探討了IGF-1對hPDLSCs增殖和分化的影響，研究表明，IGF-1促進人牙周膜成纖維細胞的增殖和膠原合成，進一步促進牙周膜成纖維細胞的分化。

3 支架材料

理想的支架材料應具有以下特點：材料易獲取；具有良好的生物相容性和生物安全性，不引起機體免疫排斥反應；具有多孔性，使氧氣和營養物質充分流通，能夠為細胞分化增殖提供良好環境；具有生物可降解性等［20］。常用的支架材料根據成分可以分為3類，即天然衍生材料、人工合成材料和復合支架材料。

3.1 天然衍生材料

天然衍生材料是動、植物體內天然存在的大分子材料，因此具有良好的生物相容性和親水性，細胞毒性和抗原性較弱，且具有較好的生物可降解性，但其機械強度低，力學性能較差［21］。牙周組織工程中常用的天然衍生材料主要有膠原、殼聚糖、藻酸鹽、絲素蛋白、天然骨組織等。

3.1.1 膠原：膠原作為支架材料，具有生物相容性好、毒性小、能夠促進組織愈合等優點。近期，KAWAMOTO等［22］制備了一種新型的含有碳基二維層狀材料的三維膠原支架，稱為氧化石墨烯（graphene oxide，GO）支架。該團隊對GO支架進行了細胞毒性試驗和組織反應性試驗，并在術后4周將GO支架植入犬Ⅱ類分叉缺損處，觀察牙周愈合情況。結果表明，GO支架具較低的細胞毒性，增強了大鼠的細胞生長行為和骨形成能力。此外，GO支架植入后牙周附著形成明顯增加，具有良好的骨和牙周組織形成能力。因此，GO支架是一種有希望的牙周組織工程的支架材料。

3.1.2 殼聚糖：殼聚糖是近年來研究較多的天然衍生支架材料，是幾丁質經過脫乙酰作用后得到的自然界中唯一的陽離子多聚糖。幾丁質在自然界廣泛存在，原料獲取簡單，并有利于細胞黏附和攜載生長因子，且具有良好的生物可降解性，可降解為葡萄糖胺和殼寡糖，隨機體代謝排出［23］。VARONI等［24］的研究合成了一種基于殼聚糖的三層多孔支架，以實現由多組織同時愈合驅動的牙周再生。采用裸鼠牙周異位模型，將人牙齦成纖維細胞、成骨細胞和牙周膜成纖維細胞作為支架，在中等分子量殼聚糖區發現致密的礦化基質，牙本質界面有弱礦化沉積。結果表明，這種可吸收的三層支架是一種有希望的牙周再生支架材料。

3.2 人工合成材料

人工合成材料除了生物相容性好、可降解外，還具有可塑性好、加工靈活以及可進行化學修飾的特點。主要分為人工合成有機高分子聚合物和人工合成無機材料兩大類，常用的人工合成有機高分子聚合物有聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內酯等，人工合成無機材料主要包括生物陶瓷類材料（如羥基磷灰石及納米羥基磷灰石、磷酸三鈣）、鈦及鈦合金、磷酸鈣水泥等。

羥基磷灰石及納米羥基磷灰石：羥基磷灰石的生物相容性和化學穩定好，能與體內天然骨組織形成具有一定生物力學強度的骨鍵合［25］，因此在牙周組織工程中作為支架材料被廣泛應用。FIGLIUZZI等［26］的臨床研究發現，在牙周炎患者的骨缺損處充填羥基磷灰石，術后有明顯的牙周組織修復。但因其降解速率慢、脆性大、塑形性較差等不足，納米羥基磷灰石應運而生。體內天然骨中的羥基磷灰石是以納米級針狀單晶體形式存在，納米羥基磷灰石在納米結構上與人體骨相似。納米羥基磷灰石的納米結構使其具有更大的表面積和較高的表面自由能，此特征有利于種子細胞黏附、增殖和遷移。TANSRIRATANAWONG等［27］的最新研究比較了具有羥基磷灰石樣表面的磷酸氫鈣（calcium hydrogen phosphate with a hydroxyapatite-like surface，CHP-HA）與傳統的納米羥基磷灰石的細胞附著、增殖和成骨分化情況。用CHP-HA或納米羥基磷灰石培養PDLSCs，進行細胞黏附、增殖和成骨分化試驗。結果表明，用這種新的CHP-HA培養的PDLSCs表現出更強的細胞反應，研究認為CHP-HA可能是一種很有前途的替代生物材料。

3.3 復合支架材料

復合支架材料是將2種或2種以上的支架材料運用特殊制備方法按比例混合而成，以充分發揮不同支架材料的優勢，彌補其缺陷，從而更好地完成引導牙周組織再生的作用。陳立紅等［28］采用冷凍干燥法制備不同比例的殼聚糖/聚乳酸復合支架，結果發現此復合支架既有足夠的孔隙率以保證細胞的黏附和營養物質流通，又改善了孔隙率高時力學強度不足的缺陷。D’ANT等［29］成功制備了聚己內酯/羥基磷灰石復合支架，該支架的機械性能有所加強，且促進了細胞增殖和骨組織再生。但各類材料的最佳搭配方式、混合比例、制備技術等方面仍有許多問題亟待解決。

綜上所述，牙周組織工程在牙周治療中擁有廣闊的前景，是牙周組織得以重建的關鍵技術。國內外研究人員對牙周組織工程中種子細胞、生長因子、支架材料三大要素的探索從未止步，各個要素之間聯合作用的研究也愈來愈多，今后牙周組織工程仍有很多問題亟待研究。期待可以尋求到種子細胞、生長因子、支架材料最佳的組合及結合方式，并成功運用于動物實驗模型，實現牙周組織外形、結構和功能的再生，為臨床治療牙周病提供理論基礎和科學依據。